[注意][推荐][原创]参蛇偏瘫胶囊对局灶脑缺血大鼠降钙素基因相关肽和内皮素含量的

baihao

周刚1 韩群英2 赵敏3 韩彩红2 王忠4 荆志伟4
1．北京中医药大学 北京 100029；2.河南省中医中风病工程技术研究中心 郑州 450008；3.天津中医学院 天津 300193；4.中国中医研究院西苑医院，北京，100091；）
摘要 目的：观察参蛇偏瘫胶囊对大鼠局灶脑缺血模型神经肽的影响，探讨其治疗脑缺血的可能机制。方法：采用FeCl3致大脑中动脉栓塞模型，应用放免法测定SD和自发性高血压大鼠(HSR)血浆、下丘脑中ET和CGRP含量。结果：参蛇偏瘫胶囊可明显拮抗缺血24h以内的血浆CGRP降低及ET的升高，提高SHR脑缺血时脑组织CGRP含量。结论：参蛇偏瘫胶囊主要对缺血早期CGRP和ET的异常变化有改善作用，而对缺血后期神经肽尚无明显影响，且以升高血浆及下丘脑中CGRP含量为主，对血浆ET的升高也有一定影响。
关键词：中风；参蛇偏瘫胶囊；降钙素基因相关肽；内皮素
Effect of SPC on CGRP And ET in Rats With Focal Cerebral Ischemia ZHOU Gang1, HAN Qun-ying 2, ZHAO Min 3,HAN Cai-hong2, WANG Zhong4 JING Zhi-wei4
(1 Beijing University of Chinese Medicine,Beingjing 100029,China;2 Henan R&D Center of Stroke in TCM,Zhengzhou 450008;3,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine Tianjin 300193,China;4 Xiyuan Hospital affiliated by China Academy of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100091,China)
Abstract Objective：To in vestigate the effect of Shenshe Piantan Capusle(SPC) on neuropeptide in focal stroke rats and elucidate the mechanisms.Methods:The content of endothelin(ET) and calcitonin gene related peptide(CGRP) in plasma and hypothalamus was measured via radioimmunoassay in both SD rats and spontaneous hypertension rats(SHR) with middle cerebral artery infarction.Results:Oral treatment with SPC counteracted both the decrease of CGRP and rise of NT in plasma during 24 hours after in farction and increased CGRP level in ischemic region in SHR.Conclusion:SPC increases CGRP level in both plasma and hypothalamus，and in hibits the increase of plasma NT in the early phase of stroke，no action on neuropeptide in the late phase of stroke was observed.
Keywords:Stroke；Shenshe Piantan Capsule；Calcitonin gene related peptide；Endothelin
新近研究显示，脑血管疾病是目前世界上导致人类死亡的三大主要疾病之一，在不少地区是第一死因，高残疾率和高复发率困扰着人们，成为国内外重点防治的疾病。降钙素基因相关肽(Calcitoningene related peptide，CGRP) 和内皮素(Endothelin，ET)分别是体内最强的舒血管和缩血管活性多肽，成为缺血性脑血管疾病研究中的热点。参蛇偏瘫胶囊为上市新药，由人参、金钱白花蛇、鳖甲、水蛭、鹿角胶等15味中药组成，具有益气补肾，活血化瘀，熄风通络之功效，具有可靠的质量标准[ ]，临床上用于治疗缺血性脑血管疾病取得了较好的疗效 。本实验对SD大鼠及自发性高血压大鼠(SHR)复制局灶脑缺血模型，观察参蛇偏瘫胶囊对ET及CGRP的影响，探讨其治疗缺血性脑血管病的机理。
1 材料与方法
1．1 动物：普通级健康SD大鼠和自发性高血压大鼠(SHR)，均为6～8周龄，雌雄各半，体重180～240g。由河南省实验动物中心提供。大鼠合格证号：医动字第410117号。
1．2 药品：参蛇偏瘫胶囊（粉），郑州羚瑞制药有限公司提供（国药准字：B20040027），1g粉含饮片4g。尿激酶：天津市生物化学制药厂生产，批号20020301。尼莫地平，丽珠集团丽珠制药厂生产，批号021101。CGRP(批号：2004-11-25)及ET(批号：2004-11-25)放免药盒购自解放军总医院科技开发中心放免所。
1.3 局灶脑缺血大鼠模型的制备 按较为公认的模型制作方法[ ]，取体重250~300g SD大鼠或SHR大鼠，戊巴比妥钠(35mg/kg，ip)麻醉，常规消毒，在右眼外眦与右外耳道连线的中点作一弧形切口，分离颞肌，沿颧弓向下分离至蝶骨大翼，用牙科钻开一4×4mm的骨窗，在此处找到中动脉分枝，取直径约0.5mm、长约5cm棉线，以50%FeCl3润湿一端(约0.5mm)，沿中动脉分枝向前下方伸进0.5mm左右，贴于其前下段，润湿棉球覆盖，放置20min后取出棉线，缝合切口即可。假手术组按上法以注射生理盐水替代50%FeCl3润湿棉线。
1.4 分组及给药 缺血早期：SD大鼠造模手术完毕后，按体重分层随机分为7组，即假手术组、模型组、参蛇偏瘫胶囊大剂量(400mg饮片/kg)组、中剂量(200mg饮片/kg)组、小剂量(100mg饮片/kg)组、尼莫地平(10mg/kg)组、尿激酶组(30万U/kg)组，立即给药1次，除尿激酶组ip外，其余各组均为灌胃给药，假手术组和模型组给同体积的蒸馏水，在术后5h及23h各重复给药1次，术后6h和24h经眼眶采血，分离血浆，备用；并在24h采血后处死取脑，干冰速冻，-80℃保存备用。
缺血后期：另取SD大鼠，按上述方法造模，手术完毕后，分组情况同急性期，立即给药1次，除尿激酶组外，其余各组均为灌胃给药，假手术组和模型组给同体积的蒸馏水，6h后重复给药1次，次日至第7日每日给药1次，末次给药后1h采血，处死取脑，干冰速冻，-80℃保存备用。
SHR处理：取SHR大鼠，按上述方法复制局灶脑缺血大鼠模型，手术完毕后，随机分为5组，即假手术组、模型组、参蛇偏瘫胶囊大剂量(400mg饮片/kg)组、中剂量(200mg饮片/kg)组、尼莫地平(10mg/kg)组，术后立即给药1次，在术后6h及23h各重复给药1次，末次给药后1h处死取脑，干冰速冻，-80℃保存备用。
1.5 组织取材和处理 取大鼠眼眶血约3ml，放入已加有10%EDTA-2Na30 μl和抑肽酶1500U的离心管中，离心分离血浆，分别测定ET和CGRP含量。取大鼠全脑，生理盐水煮沸10min，以灰结节及视交叉之间的中心点为中心确定下丘脑，分别称取一定量的下丘脑组织，加入1N冰醋酸700μl，匀浆，加1N NaOH 700μl中和，离心取上清分别测定ET和CGRP含量。血浆中ET和CGRP含量以pg/mL表示，组织中以pg/mg组织湿重表示。
1．6 统计学处理 应用SPSS10.0统计系统进行处理。计量资料数据以均数±标准差（—χ±s）表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析，方差不齐时采用近似t检验，连续时间点的组间比较采用重复测量资料的方差分析。
2 结果
2.1 参蛇偏瘫胶囊对CGRP含量的影响 由表1结果可见，大鼠局灶脑缺血6h后，血浆CGRP含量一过性显著升高，24h时低于假手术组，在造模后第7d又升至正常水平。参蛇偏瘫胶囊中剂量组对脑缺血6h血浆中CGRP一过性升高有影响，大、中、小三个剂量组对缺血24hCGRP的降低均有显著性的拮抗作用，对缺血晚期未见明显影响。表2显示，大鼠局灶脑缺血后24h和7d，下丘脑组织中CGRP含量均无明显改变，参蛇偏瘫胶囊对此亦未见明显影响。
表1 参蛇偏瘫胶囊对局灶脑缺血大鼠血浆CGRP含量的影响（±s）
组别 剂量 (mg/kg)CGRP(pg/mL)
6h24h7d
假手术组 － 217.47±183.61(9)224.21±129.19(8)188.68±33.94(11)
模型组 － 634.37±447.19(7)1)102.04±54.69(9)1)175.17±73.75(11)
尿激酶 30万U272.94±192.53(10)454.55±329.542(7)2)209.37±132.97(12)
尼莫地平 10499.24±244.29(9)297.79±155.997(7)2)194.77±55.29(12)
参蛇偏瘫胶囊 100272.95±147.12(9)177.97±39.95(8)2)209.79±77.07(11)
200225.47±105.15(7)2)277.79±191.11(9)2)173.91±40.13(12)
400443.77±179.70(9)329.73±237.59(7)2)174.49±95.57(12)
注：与假手术组比较1)P<0.05；与模型组比较2)P<0.05；()括号内为例数n。下同。
表2 参蛇偏瘫胶囊对局灶脑缺血大鼠下丘脑CGRP含量的影响（±s）
组别 剂量 (mg/kg)CGRP(pg/mL)
造模后24h造模后7d
假手术组 － 11.91±3.70(7)14.79±2.19(11)
模型组 － 15.73±3.79(7)15.71±1.37(12)
尿激酶 30万U11.54±4.94(10)14.03±3.04(11)
尼莫地平 1012.92±4.74(7)14.59±2.05(11)
参蛇偏瘫胶囊 10011.73±5.29(9)15.49±4.59(7)
20012.37±4.70(9)15.97±5.45(12)
40010.40±5.34(7)15.12±4.14(12)
2.2 参蛇偏瘫胶囊对ET含量的影响 如表3所示，参蛇偏瘫胶囊大、中、小三个剂量组对大鼠局灶脑缺血6和24h血浆中ET含量的增高均有不同程度的拮抗作用，对缺血7d后ET含量的降低无明显影响。本实验条件下，无论在缺血后24小或7d，无论给药与否，均未能测出SD大鼠下丘脑组织中ET含量。
表3 参蛇偏瘫胶囊对局灶脑缺血大鼠血浆ET含量的影响（±s）
组别 剂量 (mg/kg)CGRP(pg/mL)
6h24h7d
假手术组 － 79.59±30.65(9)113.77±17.74(10)299.71±90.70(11)
模型组 － 139.17±23.21(12)135.12±27.02(11)1)237.31±37.01(13)2)
尿激酶 30万U111.77±17.05(10)3)114.27±17.07(10)3)241.45±45.13(12)
尼莫地平 10102.19±17.01(11)4)107.35±12.09(11)4)252.94±52.53(12)
参蛇偏瘫胶囊 100105.07±25.04(11)4)107.71±14.45(12)3)243.73±53.47(11)
20073.95±22.29(12)4)109.57±19.49(12)3)227.47±47.97(12)
400141.71±37.39(11)99.79±19.91(11)4)259.92±47.79(12)
注：与假手术组比较1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P<0.05，4)P<0.01。
2.3 参蛇偏瘫胶囊对SHR下丘脑CGRP和ET含量的影响 SHR大鼠局灶脑缺血后24h，下丘脑ET含量无明显改变，参蛇偏瘫胶囊对此亦未见明显影响，对CGRP含量的降低则有拮抗作用(表4)。
表4 参蛇偏瘫胶囊对SHR下丘脑CGRP和ET含量的影响（±s）
组别 剂量(mg/kg)ET(pg/mg脑湿重)CGR/(pg/mg脑湿重)
假手术组 － 5.29±0.72(5)17.91±5.07(4)
模型组 － 5.05±0.92(4)10.57±2.091(5)1)
尼莫地平 105.49±0.99(5)13.03±0.95(4)
参蛇偏瘫胶囊 2009.19±0.99(5)19.40±2.77(5)2)
4007.21±2.44(4)12.77±3.19(4)
注：与假手术组比较1)P<0.05；与模型组比较2)P<0.05。
3 讨论
　　ET是内皮细胞释放的一种体内缩血管作用最强、作用时间最久的活性物质，在体内分布广泛，在中枢神经系统又以下丘脑和纹状体中的含量最高[ ]。CGRP作为一种体内最强的舒血管物质和神经递质在体内作用广泛，是一种多功能的生理调节肽，对全身血管有不同程度的扩张作用，尤对脑、心血管的作用更为显著。ET和CGRP这两种作用相反的多肽物质在中枢神经系统内可作为一种神经介质，在外周血液中又是循环激素，对血循环特别是脑血液循环起着重要作用，并参与了缺血性脑损伤的发生发展过程。
　　近年来，ET和CGRP的平衡失调在脑栓塞病情发展、预后和治疗中的作用引起了临床学家的重视。已有病例检测结果初步表明，脑栓塞患者的病变严重程度与血浆ET含量呈正相关，与血浆CGRP含量呈负相关[ ]，纠正ET和CGRP的平衡失凋可能是治疗脑栓塞的一种新途径。
　　本实验结果表明，SD大鼠脑缺血发生后血浆ET和CGRP水平发生时相变化。在缺血早期，CGRP呈一过性升高，与文献报道一致[ ][ ]，缺血后24h，CGRP又明显低于假手术组，造模后第7d，CGRP恢复至正常水平。缺血缺氧可造成脑组织ET的合成和释放增加，而CGRP能拮抗ET的作用，并有可能促进梗塞后侧支循环血管的开放。因此，缺血早期CGRP水平的增高可能是一种代偿机制。参蛇偏瘫胶囊对这种代偿机制尚未见明显影响(由于实验检测点的间隔较大，是否促进其代偿机制提前或延后，尚待今后观察)，但可明显拮抗造模后24hCGRP降低。SD大鼠脑缺血造模后6和24h，血浆ET含量较假手术组有所升高，分别相当于后者的152%和119%；给药后可使升高的血浆ET含量显著降低。造模第7d血浆ET值比假手术组有所降低，参蛇偏瘫胶囊治疗组的相应值仍略低于造模组，其差异未发现统计学意义。
　　既往研究表明[ ]，SHR大鼠下丘脑ET及CGRP含量高于普通大鼠。本实验中，同样条件下未能测出SD大鼠下丘脑组织中ET含量，在SHR大鼠相应组织中则有较明显表达，与报道一致。参蛇偏瘫胶囊对造模动物下丘脑的ET含量未见明显影响，却可升高低水平的CGRP值。
总结本实验，参蛇偏瘫胶囊主要对缺血早期ET及CGRP的异常变化有改善作用，而对缺血后期神经肽尚无明显影响，且以升高血浆及下丘脑中CGRP含量为主，对血浆ET的降低也有影响，从而使二者保持稳定，改善脑血管的舒缩状态，并发挥CGRP对神经细胞缺血损伤的保护作用。其干预脑缺血损伤级联反应的其他机制有待进一步研究。
参考文献
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