|
[注意]近期国家一类学分(5分)考试资料,晋职称的请进
根据文献我们用乙腈既去除人血清中蛋白,又提取血清中冠心Ⅱ号来源的阿魏酸(Ferulic acid,FA),用香豆精作内标,高效液相色谱法测定。结果表明乙腈去除蛋白不完全,且重复性差。改用沸水浴处理上述样品,同样用上述色谱条件,测定结果良好,现报告如下。
一、材料与方法
1 仪器 Waters990高效液相色谱,配Waters991光电二级管阵列检测器(3D-HPLC),用于复方体内成分峰纯度鉴定。贝克曼640分光光度计,用于化学成分的紫外扫描。贝克曼高效液相色谱(HPLC)仪,165可变波长双通道紫外-可见检测器能设双波长,用于FA定量。超微型搅拌器为江苏海门其林医用仪器厂产品。
2 药物、试剂 FA对照品(批号:773-9203),中国药品生物制品检定所提供。香豆精对照品(批号880615),含量>99%,熔点6819~7010℃,购于中国医药公司北京采购供应站。醋酸、甲醇、乙腈均为AR级。川芎购自四川都江堰市医药公司石羊镇医药批发站。丹参和赤芍均购自四川省中江县,以上3药均分别经过鉴定。降香和红花饮片购于西安市药材公司。冠心Ⅱ号由川芎、赤芍、红花、降香和丹参组成,前4味药各取500g和后1味药材1000g,常水冲洗2次,采用分煎(每次30min,共2次),最后按1∶1∶1∶1∶2(其中丹参为2)比例方式混合。健康人空白混合血清由本院血库提供。
3 标准溶液制备 精称FA3.37mg于50ml棕色容量瓶中,用流动相稀释至刻度成母液1(67.4mg/L),母液1稀释20倍后成母液2(3.37mg/L),精称香豆精5.03mg于100ml棕色容量瓶中,加0.3ml无水甲醇助溶后用双蒸水稀释至刻度(50.3mg/L)成母液3,上述配制好的标准溶液密封后置4℃冰箱待用。
4 受试对象 健康自愿者5名,男3名,女2名;年龄17~38岁,平均(27.6±7.6)岁; 体重50~72.5kg,平均( 55.4±8.7)kg;血压、心率、脉搏均正常,无心、肝、肾和胃肠道等疾患。服药前空服14h,并未饮含酒精类饮料,未吸烟,受试期间正常饮水。
5 实验设计 首先统一煎煮冠心Ⅱ号汤液,并制备好足够的汤液。选择一名受试对象,按3g/kg剂量服用冠心Ⅱ号汤液,30min后取血得血清,按文献方法用乙腈进行预处理,用HPLC 进行测定并与化学对照品对照,初步定性成功,但重复性差;后改用水浴法进行样品预处理。选择受试对象再次以3g/kg服用冠心Ⅱ号汤液,服药前及服药后5、10 、15、30、45、60、90、120、180、240min时间点各取血得血清1ml,其中30min组取血得血清5ml以作为进一步定性用。上述目的旨在确定服药后的合适取血时间、取血量和确定标准曲线范围并测定。用3D-HPLC和紫外扫描仪进一步定性汤液(体外)与服用汤液后血清样品中的所测组分。根据上述预实验的明确结论,确定最优色谱条件、样品预处理方法及标准曲线测定方法。
6 紫外波长测定 分两种,一种用分光光度计进行,另一种用3D-HPLC的二极管阵列检测器进行。FA、内标香豆精对照品、汤液及预处理后的血清样品中的靶成分均进行紫外扫描以定性。
7 色谱条件 C18(HYPERSIL填料,ODS2)色谱柱(大连依利特科学仪器有限公司)150mm×4.6mm,5μm为固定相,流动相参考文献,为甲醇∶乙酸∶水(38∶0.3∶61.7,v/v/v) ,该流动相用于2D-HPLC。3D-HPLC的流动相用甲醇-磷酸缓冲液( 0.01mol/L,pH3.0),流速1.0ml/min;贝克曼和Waters仪器自带脱气装置,3D-HPLC 流速017ml/min。因FA和阿魏酸钠的对照紫外谱图有一较高的280nm左右的肩峰,且川芎中含有的川芎嗪的紫外吸收波长为280nm,所以贝克曼HPLC设320nm和280nm两个波长。3D-HPLC的紫外波长为200~400nm。纸速为每屏幕60min和10min两种。
8 样品预处理方法 先用文献方法:精密量取空白血清1ml于5ml玻璃尖底离心试管中,分别加一定浓度内标,加不同浓度的FA后,旋涡振荡15s混匀,然后加2.4ml乙腈后再次旋涡振荡15s混匀,3000r/min离心10min ,将有机层移至另一5ml尖底离心试管中,在60℃水浴和氮气下吹干后用100μl甲醇重溶,20μl进样测定。因色谱结果不佳改用水浴法。水浴法: 取10ml玻璃尖底离心试管,分别加入30μl水、50μl内标母液3(针尖插入水中)、不同浓度的FA液、再加入水(使每管容积相同)、1ml空白血清,然后旋涡混匀15s,100℃水浴10min,用超微型搅拌器搅拌1min制成匀浆,12000r/min离心15min,取上清直接进行HPLC测定或置于1ml尖底塑料试管中存-18℃冰箱待测。
9 定性与定量计算及方法学比较标准 比较对照品、样品所测组分的2D-HPLC的保留时间、3D-HPLC的峰纯度和紫外扫描波长是否一致给予定性。以FA浓度为自变量,他们的峰面积或峰高与内标的比值为因变量,求出标准曲线的回归方程计算FA的浓度。以色谱图的组分峰的分离情况、峰面积的稳定性与重复性作为乙腈法和水浴法的比较标准,并比较样品预处理方法。
二、结果
1 样品预处理方法的比较 见图1。图中的峰1和峰2为FA和内标,乙腈不能使FA峰与血清内源性物质完全分开(图1中B和C)。由于除蛋白差致使保留时间到5min才使谱图接近基线(图1中的A~D),而且因内标忽高忽低使定量结果的重复性太差(图1中B~D)。而水浴法的沉淀蛋白效果、FA峰与其他峰的分离均良好(图1中E~F)。内标峰稳定而重复性好(图略)。
2 定性分析 用2D-HPLC定性结果,见图1。健康人服用冠心Ⅱ号后血清样品经水浴后直接测定的1号峰与FA对照品保留时间一致,加FA对照品后,1号峰明显增高,并可初步定性(图1中G和H)。分光光度计测定值说明沸水浴对FA的最大紫外吸收无影响。FA加入血清的紫外吸收波长的最大吸收亦为320nm,约280nm处的肩峰略高是由于血清所致(图略)。3D-HPLC色谱结果表明健康人服用冠心Ⅱ号后血清中一成分与FA对照品的一致。故可将1号峰鉴定为FA。
3 标准曲线 按样品预处理项下的水浴法操作,FA浓度线性范围是33.7、67.4、134.8、269.6、539.2、1078.4和2156.8μg/L。每个浓度组6个样品,进样量33.7μg/ L组为200μl,余为50μl。测得标准曲线:Y=0.0022X +0.0713,r=0.9993。
4 回收率及精密度试验 3种浓度按样品预处理项下和标准曲线项下处理和测定。血清FA的方法回收率(指测得结果与真实值的接近程度,表示分析方法测量的正确性。)见表1,其平均回收率为(93.59±2.36)%。精密度为日内(24h内) 测定结果的统计分析,日间精密度为30天内日间测定结果的统计分析,见表2。
5 检测限(limit of quantitation,LOQ,指在保证具有一定可靠性的前提下,分析方法能够测定出的样品中药物的最低浓度。) FA的最低检出限为6ng。按样品预处理项下操作测定,水浴10min时的最低检测浓度为20.2μg/L(以上的信/噪比为3) 。
6 专一性 水浴法处理后色谱图基线平稳,最先洗脱的蛋白杂峰峰面积小,不存在血清中内源性成分、川芎中其他成分(见图1中的E~H)对FA的干扰,而乙腈法则存在上述困扰(见图1中的A~D)。
7 本方法采用健康自愿者空腹服冠心Ⅱ号汤(3g/ kg) 前及后5、10、15、30、45、60、90、120、180和240min取血得血清1ml,置-18℃冰箱保存,这些样品除不加FA标准液外,均同样品预处理方法。结果健康人服冠心Ⅱ号后血清FA的药动学(PK)参数为:Ke=0.0012min-1; Ka=0.6083min-1;t1/2Ka=1.1394min;t1/2Ke= 563.0283min;Tp=14.1881min;Cmax=40.6316mg/L;AUC=33421.8710mg•min-1•L-1; Cl/F(S)=0.0008ml•kg-1•min-1;V/F(C)=0.6738L/kg。
三、讨 论
1 方法学色谱图和数据(图1,表1~2) 表明:本研究建立了服用冠心Ⅱ号后血清FA测定的新方法,该方法特点是简便、高效、无毒、灵敏、精确、价廉、快速而专一。体现如下:仅一步性提取,不需要有机溶剂一步性提取时的氮气吹干并重溶,因此远为简便、省时和价廉,并可单独大规模制备样品;水浴法不使用有机溶剂,因而无毒;水浴法条件易于控制,引入外来因素少,大批量一次性完成,所以该方法非常的精确、灵敏和重复性好。这是经典法及我们以往用乙腈法、三氯甲烷提取补骨脂素、川芎嗪等预处理法所无法比拟的。
2 许多西药体内药物分析的定性,仅用保留时间与对照品是否一致来确定,而本研究采用了二极管阵列检测器和光谱学数据来鉴定川芎进入人体内的FA,很有必要,可以判断同一保留时间的不同波长上是否有其他成分,可以保证定性的准确,为进一步定量奠定基础。
3 迄今所有复方PK文献中的血样预处理没有采用水浴法。水浴法可能“较适合”复方生物药物分析法:因为复方水煎液中的化学成分能耐受长时间的沸水高温和水解作用,当它们在血清中被沸水浴提取时同样能够耐受,这些成分在体内与体外所面临处理的条件和环境基本一致;另一“较适合”的依据是:血清中源自复方成分以水溶性成分为主,兼有双溶性成分,或部分脂溶性成分但能溶于热水。而目前西药化学品主体为脂溶性成分,这可能是目前西药体内药物分析很少采用水浴法的原因。
4 PK参数表明健康人服用较大剂量的冠心Ⅱ号后,血清中FA吸收非常迅速(见Ka、t1/2Ka和Tp值),消除缓慢(见Ke、t1/2 Ke和Cl/F(S)值)。为汤剂药效迅速提供了直接临床PK证据。其PK的其他意义需要进一步研究。
5 作为一个新方法,本实验仅为初步实践。水浴法预处理复方血清成分,广泛应用性如何? 不同动物血清中复方来源的FA,用水浴法提取的规律性如何?水浴时间如在本文中延长至15min如何?对色谱柱的污染如何?加预柱或样品上清过滤后对柱子的影响如何?水浴加强酸等改变条件时的提取效果,除蛋白效果如何均不清楚,我们正在研究中。
|
|