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2.4 细胞活力分析 RAW 264.7癌细胞培养在气功外气水培养基或对照水培养基上24 h,收集细胞,苔盼蓝染色,计数200个细胞中活细胞和死亡细胞的数目。 2.5 MTT 法检测细胞增殖 在96孔细胞板上,每孔加入100μl(5×104 个/ml)RAW 264.7癌细胞,培养24 h后,再加入10 μl MTT (Sigma, 1 mg/ml MTT)再培养4 h, 去除培养液,加入150 μl DMSO溶解,在酶联免疫检测仪上570 nm处测定OD值,电脑自动记录和保存数据。 2.6 AO/EB荧光染色与倒置显微镜观察 在6孔细胞板上,放入经多聚赖氨酸处理的玻片,每孔加入2ml(5×104 个/ml)RAW 264.7癌细胞,培养24 h后. 取出细胞爬片,PBS清洗,滴加AO/EB荧光染液染色5 min,置荧光显微镜下观察细胞凋亡情况并摄像。倒置显微镜观察6孔细胞板中RAW 264.7癌细胞的生长情况。 2.7 扫描电子显微镜观察 在气功外气水培养基或对照水培养基上已培养6 h或24 h的RAW 264.7癌细胞,取出细胞爬片,PBS清洗,乙醇脱水,乙酸异戊酯置换,CO2临界点干燥,真空镀金,于KYKY-1000B扫描电子显微镜下观察,通过WD-5扫描电镜联机图象分析系统下数码拍照,电脑保存。 2.8 新生小鼠肝细胞原代培养 取新生12 h内的小鼠肝脏,HBSS清洗,剪碎成约1m3,HBSS清洗,0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA.)37℃消化30 min,400目不锈钢网过滤,HBSS清洗,离心收集细胞。用20%新生牛血清的1640培养基 (内含100 U•mL-1青霉素、100 μg•mL-1 链霉素)调节细胞浓度为1×105 个/ml悬液,在6孔细胞板上每孔加入2 ml,置于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱培养24 h后,每孔再加入2 ml 气功外气水培养基或对照水培养基,用倒置显微镜观察小鼠肝细胞的生长情况。 2.9 统计分析 数据以x ± s表示,采用SPSS 13.0统计软件进行独立样本t检验。 3 结果 3.1 气功外气水诱导癌细胞死亡 台盼蓝染色表明,在3次重复试验中,气功外气水组细胞的平均死亡率分别为96.8%、98.2%和 93.7%,明显高于对照组细胞的死亡率(2.3%、1.8%和4.0%), 差异有显著性意义, p<0.001。结果表明,气功外气水能够引起RAW 264.7细胞死亡。 |