大鼠实验性痹证模型建立及其病理学研究

杏林奇葩

大鼠实验性痹证模型建立及其病理学研究
            中国中医研究院基础理论研究所 王安民 吕爱平 曾晓莲
ESTABLISHMENT OF AN XPERIMENTAL MODEL OF "BI" SYNDROME ON RATS AND ITS PATHOLOGICAL STUDIES
Wang An-min et al
Institute of Basic Theory of TCM , China Academy of Traditional Chinese Medicine ,Beijing , China
SYNOPSIS: The "BI" syndrome in rats is induced by intradermal injcetion of type-Ⅱcollagen with incomplete Freud';s adjuvant .It shows synovial proliferation ,inflammmation of synovium ,damage of articular cartilage ,adding the ecogenous cold and damp factor ,the pathological changes were axacerbated . So, it is similar to the change of human rheumatoid arthritis.
    内容提要：本研究运用Ⅱ型胶原加不完全弗氏佐剂皮内注射造成大鼠的自身免疫性关节炎模型，其病理变化显示：滑膜细胞增生，滑膜组织炎症，关节软骨表面破损，类似人类类风湿性关节炎的病理改变；加用外界寒湿因素，能加重病变。因而，该动物模型可以作为中医痹证的研究对象。
    痹证，是指人体营卫气血失调，肌表、经络遭受风寒、湿热之邪侵袭，气血经络为病邪闭阻而引起的经脉、肌肤、关节、筋骨疼痛、麻木、重着、屈伸不利或关节肿大、僵直、畸形、肌肉萎缩，严重者影响脏腑等了临床特征的一类疾病。临床上，以关节病变最为多见，相当于现代医学中风湿性关节炎，类风湿性关节炎等，它们都属于胶原性疾病范畴，与自身免疫有关。本实验的目的应在于用Ⅱ型胶原作为抗原，建立一个适合中医痹证研究的动物模型，并观察寒湿因素对该模型的影响，从病理学角度来探讨痹证与该模型的关系。
材料与方法
    1．粗取Ⅱ型胶原   参考国内外文献1、2、3方法并加以改进。（1）取小牛关节软骨。
（2）蒸馏水充分洗涤。（3）捣碎。（4）加入10倍体积的0.05M乙酸一一乙酸钠缓冲液（pH5.8），浸泡4天。（5）加入盐酸胍、碘代乙酸镑和EDTANa2，使之终浓度分别为4.0M、0.005M和0.025M，在4℃下充分搅拌48小时。（6）12000g、4℃下离心30分钟。（7）取沉淀，加10倍体积的0.5M乙酸，再接1：0.002比例加入胃蛋白酶，4℃下持续搅拌48小时。（8）12000g、4℃下离心30分钟。（9）取上清，对0.2M NaCl·0.05 M Tris一HCI缓冲液充分遗析。（10）按100:1比例，与予处理过的DEAE混合。（11）12000g、4℃下离心30分钟。（12）取上清，加入NaC1，使之终浓度为3.2m，静止24小时。（13）50000g、4℃下离心30分钟。（14）取上清，对0.01M Na2HPO4充分透析。（15）12000g、4℃下离心30分钟。（16）取沉淀，加入0.5M乙酸使之充分溶解。（17）对蒸馏水充分透析。（18）对去离子水充分透析。（19）冷冻干燥，待用。
    2．实验对象及分组   选用56只雄性Wistar大白鼠为实验对象（体重90克左右），随机分成三组：单纯造模组20只，寒湿造模组20只和对照组16只，分别简称单纯组、寒湿组和对照组。
    3．造模方法（1）单纯组取一定量的Ⅱ型胶原粗提物，用0.5M乙酸溶解，使之终浓度为15mg／ml，加入等量的不完全弗氏佐剂，充分乳化。取乳化后的混合物0.125m1，于大自鼠尾部、踝部多处皮内注射免疫动物。每只动物注射一次，含Ⅱ型胶原粗提物1.8mg。（2）寒湿组免疫注射前，将大白鼠放于冷水中（温度为15℃一17℃）游泳5一7分钟，每日一次，连续7天，再按单纯组进行免疫注射。（3）对照组8只动物在冷水中游泳（如前法）连续7天，每天1次，不加用免疫注射；8只动物不加任何因素。
    4．处死方式与处死时间   全部动物行颈椎脱臼处死。单纯组动物20只分别于免疫注射后第7天、第15天、第30天和第45天处死，每次5只；寒湿组动物20只处死时间按单纯组时间；对照组动物16只，8只游泳后动物，对应于寒湿组时间处死，每次2只，8只不加任何条件的动物，对应于单纯组时间处死，每次2只。
    5．取材   取动物踝、膝、时和腕关节、胸腺、脾脏、心、肝、肾。十二指肠、空肠、肺和肾上腺作光镜切片；取左膝髌骨下滑膜组织作冰冻切片：取左膝胫骨上端关节表面作扫描电镜标本；断尾取血，作血涂片；横断脾脏，载玻片上印片。
    6．染色方法 （1）H、E染色。（2）磷钨酸苏木素染色法4。（3）酸性磷酸酶染色法5。（4）α一醋酸禁酯酶染色法。（5）细胞色素氧化酶染色法12。（6）琥珀酸脱氢酶显示法。（7）免疫荧光染色法5。
结  果
    1．大体改变   肉眼观察，单纯组和寒湿组动物均可见毛发失去光泽，懒动。免疫后第7天和第15天时寒湿组动物体重减轻（P ＜0.05）。单纯组和寒湿组部分动物可见踝关节明显红肿，触及时可见逃避反射。
    2．单纯组关节病理变化  免疫注射后第7天可见滑膜组织充血、水肿、纤维素渗出，滑膜细胞轻度增生、排列不规则：滑膜组织中可见淋巴细胞、单核细胞及少量散在分布的中性粒细胞浸润，有时，关节腔内可见淋巴细胞、单核细胞和少量中性粒细胞。腱围组织和纤维囊周围结缔组织充血、水肿、炎细胞浸润（以淋巴细胞为主）。免疫注射后第15天，除上述改变外，滑膜细胞增生、肥大更加明显，滑膜细胞呈多层柱状排列，滑膜组织内可见血管扩张充血，毛细血管增生，有的可见小血管壁轻度增厚。免疫注射后第30天，关节软骨表面扁平层细胞剥脱，软骨细胞间隙大小不一，基质深浅不一，甚至软骨细胞变性、坏死，关节软骨表面缺损；此时，滑膜组织充血、水肿有所消退，但仍可见淋巴细胞、单核细胞浸润，并可见纤维母细胞和纤维细胞增生以及胶原沉着；滑膜细胞增生明显，呈柱状、疏散排列，有的甚至沿关节软骨表面贴附生长，贴附的滑膜细胞下方软骨表面扁平层剥脱，软骨细胞变性。免疫注射后第45天，其病理改变基本与免疫注射后第30天相同，但可见骨的损伤，出现骨细胞变性、坏死。
    3.寒湿组关节病理变化   寒湿组关节病理变化与单纯组对比具有两个特点：病变出现率更高和软骨损伤提前出现。软骨损伤于免疫注射后第15天即可出现。单纯游泳动物未见任何病变。
    为便于计算单纯组和寒湿组的发病率,参考有关文献2、6、7，结合本研究具有时间序列上变化的特点，以滑膜细胞增生或／和排列不规则；滑膜组织纤维素渗出，炎细胞浸润（以淋巴细胞为主），或／和胶原纤维沉着；或／和关节软骨破坏作为判断动物是否存在Ⅱ型胶原所致关节炎的标准。只要有一个或一个以上关节出现上述变化，该动物即计为发病的一例。按照这个标准，单纯组20只动物有11只发病，寒湿组20只动物有15只发病。在所有发病动物的四个关节中，踝关节病变出现率最高，在单纯组和寒湿组均为100％；膝关节病变出现率，单纯组为92％，寒湿组为93%；腕关节病变出现率，单纯组为32％；寒湿组为80％；肘关节病变出现率，单纯组为78％，寒湿组为77％。单纯组与寒湿组的病变比较见表1、表2。从表1和表2中可以看出，寒湿组动物滑膜组织炎症、滑膜细胞增生和排列不规则比单纯组重（P＜0.05～0.001）。
     4.关节软骨表面扫描电镜观察   免疫注射后第15天，可见关节炎动物关节软骨表面正常规则排列的胶原纤维结构消失，出现杂乱的纤维样物质覆盖，并可见关节软骨表面出现大的凹陷。
     5．酸性磷酸酶（ACP）、α一醋酸蔡酯酶（ANAE）、琥珀酸脱氢酶（SDH）和细胞色素氧化酶的改变  造模后第15天开始，寒湿组和单纯组动物的ACP（脾脏印片）和血涂片的ANAE增加（见表3和表4），琥珀酸脱氢酶和细胞色素氧化酶减低。
     6．单纯组和寒湿组动物关节滑膜荧光抗体检测结果  用免疫荧光法，在造模后动物滑膜组织中可见黄绿色荧光，表明滑膜组织中存在抗体或抗原抗体复合物。
讨    论
    1．实验性痹证模型与人类类风湿性关节炎的关系  由于人类类风湿性关节炎病人血清中、关节腔液中均可检出抗Ⅱ型胶原抗体8、9、10，关节软骨中存在大量的Ⅱ型胶原11，在关节滑膜组织中，还可检出Ⅱ型胶原——抗Ⅱ型胶原抗体复合物12，所以说，建立该模型的出发点就是依据人类类风湿性关节炎发病的免疫机理。本实验的结果表明：滑膜细胞增生，滑膜组织中纤维素渗出，胶原纤维增生，炎细胞浸润，关节软骨细胞剥脱，甚至缺损，从病理形态学方面证明该痹证模型类似人类类风湿性关节炎；ANAE阳性细胞增多，特别是在滑膜组织中检到抗体存在，从免疫学方面同样也证实该实验性痹证类似人类类风湿性关节炎。因而，该动物模型可以作为中医痹证研究的对象，尤其是顽痹的研究对象，琥珀酸脱氢酶和细胞色素氧化酶降低，说明该模型动物滑膜组织氧化代谢功能下降。
     2．寒湿因素在实验性痹证发生发展过程中的作用  本实验结果表明：外界寒湿因素能使实验性痹证的发病率提高，同时，病变有所加重，提示外界寒湿因素是实验性痹证发生的一个重要外因（因为单纯的外界寒湿因素并未引起动物任何病变），并能促进该痹证的发展。这符合临床调查结果13。外界寒湿之所以只能使实验性痹证发生率由55％提高到75％，是因为“正气存内，邪不可干”之故。
   （本研究曾得到窦志良、李禾、李昆、陈红宾、蔡洪斌、王乃淇、侯燕鸣、谢崇芩同志的热情帮助，在此深表感谢。）
    表1  两组滑膜细胞增生和排列不规则比较
类  别      单纯组      寒湿组     合  计

出  现        30          54          84
不出现        31          19          50
合  计        61          73          134

      X2＝10.0887         P＜0.001
       表2     两组的滑膜组织炎细胞浸润比较
类  别      单纯组      寒湿组       合  计

出  现        23         42            65
不出现        38         31            69
合  计        61         73            134

     X2＝5.2541          P＜0.05
    表3单纯组不同时间酯酶阳性细胞比较（％）
类别 第7天 第15天 第30天 第45天
样品1号 64.2 74.9 75.4 74.8
样品2号 63.4 75.8 68.1 69.9
样品3号 65.3 71.5 74.1 75.7
样品4号 62.4 72.8 65.4 64.8
样品5号 63.7 77.4 78.1 70.1
X±S 63.8
±1.07
73.75
±1.95
72.2
±5.3
71.1
±4.4

      第7天与第15天比较P＜0.01
      第7天与第30天比较P＜0.01
      第7天与第45天比较P＜0.01
              寒湿组不同时间酯酶阳性细胞比较(%)
表4
类别 第7天 第15天 第30天 第45天
样品1号 64.7 74.9 74.1 78.5
样品2号 65.8 74.2 76.3 64.6
样品3号 69.4 70.1 70.4 76.9
样品4号 62.1 71.2 72.2 69.1
样品5号 64.2 76.1 76.1 71.4
X±SX 65.25
±2.69
73.3
±2.54
73.9
±2.57
70.1
±5.7

      第7天与第15天比较P＜0.05
      第7天与第30天比较P＜0.05
      第7天与第45天比较  P＜0.05
(对照组动物酯酶阳性细胞为61.4±2.01%)
           参考文献
1.  Seyer J. M, et al ; Collagen Polymorphism in Normal and Cirrhositic Human Liver . J Clin Inverst 1977;59:241
2.  Trelstad  R.L, et al : Isolation of Two Distinct Collagen from Chick Cartilage . Biochem 1970;9:4993
3.  黄国强，等，人Ⅱ型胶原的提取与纯化，卫生研究，（2）：11，1986
4.  刘介眉，等；《病理组织染色的理论方法和应用》，60页，北京人民卫生出版社，1983
5.  陈啸海，等，《组织化学技术》，304页，北京人民卫生出版社，1982
6.  张进玉，李明勤；类风湿性关节炎诊断指标的探讨，中华骨科杂志，6：27，1986
7.  Miller ,E. J. Isolation and Charaterization of a Collagen from Chick Cartillage Containing Three Identical Chains . Biochem 1971;10:1252
8.  Staffen C and Timple R. Antigenictiy of Collagen and Its Application in the Serological Investigation of  Rheumatoid Arthritis .Int Arch  Allergy Appl Immunol 1963;22:33
9.  Michael D and Fudenberg H.H . The incidence and Antigenic Specificity of Antibodies against Denatured Human Collagen in Rhumatoid Arthritis. Clin Immunopathol 1974;2:153
10.     Ardropouos N. A, et  al :Characterization of Antibodies to the Native Human Collagen and to Their Component Chains in the Sera and the Joint Fluid of Patient with Rheumatoid Arthirits ,Immunochem 1976;13:709
11.     Helen B. E, et al .Localization of Collagen Types and Fibwonectin in Cartilage by Immunofluorescence . Ann Rheum Dis 1983;42:575
12.     Roy  B.C and Clindsey   J. M. Intra-articular-collagen antibodies Complexes . Arthritis Rheum1984;27(4)suppl:73