银杏叶中烷基酚酸的体外毒性测定

灵异怪医

银杏酸具有复杂的细胞毒性作用，而这依赖于细胞类型和所使用的浓度，能引起不同模式的细胞损伤，可能最终达到细胞的凋亡或坏死。

  


　　以下对银杏酸的描述是否正确:
　　A 在中性红摄取试验中显示，银杏酸能剧烈降低细胞的存活率
　　B 银杏酸具有遗传毒性且是肿瘤促进剂
　　C 标准银杏叶提取物在中性红摄取试验中显示出细胞毒性
引言
　　
　　一般认为草本药物具有广泛的治疗作用机理和相对的低毒性，然而从植物提取的药物中仍然很可能含有对身体引起毒副作用的成分。(Shaw et al，1997；Ernst，1998)。因此对于植物药物也应当象对化学合成的药物那样对其药效、质量及安全性进行分析(Couzinier及Mamatas，1986：Saller et al，1998；De Smet，1995)。在德国，这项工作在1994年之前是由前联邦卫生当局委员会(BGA)进行的，现在则一部分是由欧洲科学植物药物协会(ESCOP)承担(Saller et al，1998)。
　　银杏叶提取物是一种用途极广的植物药物。其粗制提取物中的一组烷基酚(现在已分离出的有银杏酸(GA) )及其相关的烷基酚(例如cardanols，cardols)可能对身体有一定的危害。这些化合物具有广泛的生物学活性，例如对多种酶有抑制作用。事实上也有报道提到银杏酸的一些治疗作用(例如抗菌作用)，但是与此形成鲜明对比的是有充分的事实证明它具有细胞毒性、变应原性、免疫毒性、致突变性及致癌作用(Jaggy and Koch，1997；Siegers，1999：Nestendorf and Regan，2000；Kochet al．2000；Ahlemeyer et al．2001)。标准化的银杏叶提取物只含有微量的GA和标准含量、配比的有效活性化合物(如23-25%的黄酮甙和6%的萜内酯)，因而能保证其疗效和长期使用的安全性。
　　为了测定银杏烷基酚的毒性，以往有些学者利用中性红吸收测试法观察银杏酸等对人类及动物不同器官系统的细胞系的影响(Siegers，1999)。本试验选用两种最具代表性的被测定细胞系，即代表皮肤的人类角质细胞系HaCaT及代表肾脏的猕猴肾小球细胞系LLC-M2，来测定不同浓度的银杏酸对于细胞的生长，细胞活性的影响，并对细胞完整性及细胞形态进行了细致的观察。同时，为了进行对比，在实验模式中还用了标准化的银杏叶提取物(其中银杏酸的含量不到5ppm)作为对照。目前，该领域采用的先进技术如：高选择性柱载树脂双重吸附纯化技术，能有效保证活性成分的含量配比，并能更好的控制毒性成分。
方法
　　
　　1．银杏叶提取物和银杏酸
　　标准银杏叶提取物
　　标准银杏叶提取物是通过专利生产程序制造出来的产品，简单来说，用60% W/W丙酮从干燥银杏叶中进行提取。清除了不溶于水的亲脂性化合物，将具有鞣酸性质的高分子花青素沉淀出来，并清除烷基酚；然后用液体-液体提取法浓缩黄酮甙及萜内酯。最后，对被浓缩的活性化合物进行干燥及纯化处理(De Feudis，1998)。本研究所用的原料是同一批次的EGB761，其中银杏酸的含量为3ppm。
　　银杏酸
　　在这一项研究中，我们用的银杏酸混合物来自溶于庚烷的60% W/W丙酮提取物的分馏部分，这个物质是在制造EGb761的过程中被提取出来的；然后采用列柱色谱法，用一系列Sephadex LH20(交联葡聚糖)对银杏酸进行浓缩。最后制成的混合物中含99%的银杏酸。
　　2．细胞培养
　　LLC-MK2 细胞：肾小管上皮细胞系 LLC-MK2 来自猕猴。把细胞培养在199培养基中，含有Earle盐，再加以5%胎牛血清(FCS)。
　　HaCaT 细胞：永久性的人角质细胞系HaCaT是由Fusernig教授惠赠，培养在由Dulbecco改良的Eagles培养基中，再加以5%的FCS。
　　3．中性红摄取测定
　　把细胞以105-106/ml密度种植在24孔Falcon组织培养板上，24h后冲洗一遍，分别更换为含有标准银杏叶提取物或银杏酸的培养基，48小时后进行中性红摄取测试以便观察对细胞的生长及活力的影响(Borenfreund及Puerner1985年描述的方法)。简述如下：清除培养基后，把细胞用磷酸缓冲溶液(PBS)清洗三遍，然后加以含中性红(50mg/ml)的培养基。培养3h后去除培养基，然后用PBS彻底冲洗细胞，再加以50%含水乙醛，其中含1%乙酸。最后用光度计在波长546 nm下测量中性红的吸收率。以往的试验已证实细胞内中性红的浓度与细胞活力之间具有密切的相关性。
　　4．酶测定
　　酶测定用的细胞培养方法与中性红吸收测法相同；收集上清液用来做乳酸脱氢酶(LDH)及酸性磷酸酶(ACP)的测定。
　　LDH测定：培养基中LDH释放的测定采用专业的测试盒(Sigma诊断盒)进行，这一套仪器是根据德国临床化学协会推荐的最佳设计标准制造的。加20μl上清液于500μl试剂混合液中，利用光度计在波长334 nm下测定LDH的吸光度。
　　ACP测定：应用的测试仪器是ACP MRP1；加50μl上清液于500μl启动试剂中，然后用光度计在波长405 nm下测定酶的活性。
　　5．测定凋亡细胞
　　通过把HaCaT细胞用藻红蛋白标志的单克隆抗体Apo2.7进行染色，可以对银杏酸可能诱发的细胞凋亡进行测定。在凋亡细胞上，此抗体能和38kDa线粒体膜蛋白(7A6抗原)相互作用(Pepper et al．1998)。把银杏酸(浓度为1-100μl/ml)加于24孔微孔滴定板上邻近融合的细胞中，培养18h，然后把细胞转移至多丙烯管中进行离心处理(400×g，5min)。弃去上清液，再把细胞重新悬浮在100μl冷(4℃)的PBS中，其中含2.5%FCS、0.01%NaN3及100μg/ml洋地黄皂甙。在冰上培养20min，对细胞进行清洗，并在4℃环境中用20μlApo2.7-PE在80μl PBS中(加有2.5%FCS及0.01%NaN3)染色15min，最后用EPIES XL-MCL流式细胞仪进行细胞分析。
　　6．电子显微镜检查
　　先以105-106细胞数/ml的浓度接种细胞于组织培养瓶中。在分别含有规定浓度的标准银杏叶提取物或银杏酸的培养基中培养48小时后，进行胰蛋白酶消化。接着将细胞的悬浮液置于小试管中以1000转/秒的速度离心20分钟。沉淀物用戊二醛固定1小时，然后再离心20分钟。将沉淀物溶于含有0.22mol/l蔗糖的PBS液中，然后，在2%的OsO4中后固定30分钟。经规范操作程序将其包埋于环氧树脂812后，进行进一步处理。上述每步操作之间所取物质都要经过1000转/秒离心15分钟。取超薄部分先用醋酸双氧铀染色，继而再用枸橼酸铅染色，用Zeiss 10电子显微镜观察细胞形态。
　　7．统计
　　一般性的所有检验在四组中进行，并且所有的值均以均值加95%可信区间或均值的标准差表示，用Excel表格计算。细胞生存率用对照的百分数表示而不加以检验。半数最大抑制浓度(IC50)是在用绘图软件(GraphPAD)做非线型回归后得到的，同时也得到95%可信区间。

结果
　　采用标准银杏叶提取物培养细胞，在中性红摄取法实验中，需要比标准提取液高的浓度才可能发生细胞生存率减少50%。在HaCaT 和 LLC-MK2 细胞 IC50 值分别达到889和1481mg/l。相比来说，银杏酸混合物的IC50比较低(表1)。在每一例中，银杏酸或标准银杏提取物的浓度和细胞活性有着非常密切的关系。 LLC-MK2 细胞显示出对银杏酸毒性反应的敏感性增强，而HaCaT细胞对标准银杏提取物的抑制作用较敏感。
表1 通过中性红摄取试验得出的标准银杏提取物和固定银杏酸混合物对细胞生存率的半数抑制浓度主要结果
测试物
HaCaT
IC50(mg/l) LLC-MK2
IC50(mg/l)
标准银杏叶提取物
889
(859-938) 1481
(1439-1523)
银杏酸 21.8
(20.6-23.0) 4.6
(3.7-5.6)
　　　　　　　　　　　　　　　　 注：括号内标志95%可信区间
　　与中性红试验的结果相一致，银杏酸也引起浓度依赖的两类细胞LDH释放。银杏酸引起 LLC-MK2 细胞LDH释放的IC50值是14.2mg/l，而引起HaCaT细胞的半数最大释放LDH的浓度是35.6 mg/l。一般而言，LDH释放的IC50稍高于中性红试验的相应值(表2)。有趣的是，如LLC-MK2 细胞或HaCaT细胞在标准银杏提取物内培养，浓度达1800mg/l时LDH释放仍处在对照组范围；在LLC-MK2 细胞，当浓度在2400mg/l时，LDH释放才出现增加。
表2 银杏酸在中性红试验中的半数细胞抑制浓度和半数释放LDH浓度比较
测试模型
IC50-values(mg/l)

HaCaT
LLC-MK2

中性红试验
21.8
(20.6-23.0) 4.6
(3.7-5.6)
LDH释放 35.6
(35.0-36.2) 14.2
(13.0-15.4)
　　　　　　　　　　　　　　注：括号内标示95%可信区间
　　LLC-MK2细胞在银杏酸的存在下，向培养基释放LDH的最大值在培养后的96小时被观察到。而在提取液存在标准银杏叶提取物的情况下，培养细胞在24到96小时之内没有观察到这样的时间依赖效应。
　　ACP分析并不能提供可说明的结果是因为发现银杏酸对ACP酶活性有很强的抑制作用，因此，酶水平的测量是不可能的。
　　随着细胞培养达18小时，Apo2.7阳性细胞的比例呈浓度依赖性增加，从赋形剂处理过细胞的5.5±1.0%到用100g/ml GS处理细胞的78.8±1.9%的比例。能引起细胞50%凋亡的GS所需的浓度计算所得为31μg/ml。
　　用电子显微镜分析LLC-MK2 细胞的细胞器结构正常且线粒体呈薄层状突起。用标准银杏叶提取物(1500mg/l)培养对细胞的形态学无影响，用银杏酸(5mg/l)培养的细胞，线粒体呈长型样的转变。HaCaT细胞显示正常的细胞器和角化细胞特有的张力原纤维。用标准银杏叶提取物(200mg/l)培养对细胞的形态学无影响，用银杏酸(5mg/l)培养可在细胞浆内看到脂肪髓磷脂化体的形成。
讨论
　　使用不同器官来源的人体和动物细胞，来验证一个给定的银杏酸复合物对于细胞的生长、存活、完整性和形态学的影响，是这个实验的目的。作为对照使用的银杏酸含量少于5ppm的银杏叶标准提取物对这些指标的影响，也被进行了相应的研究。为检测细胞生长情况，一个定量的中性红摄取试验被应用。细胞浆释放LDH、溶酶体酶(ACP)和凋亡的诱导分别被检测用于收集细胞损伤部位和细胞死亡类型的信息。最后，细胞的电子显微镜分析用以提供对应于生化检验的形态学分析且可分析引起这些反应的细胞机制。
　　实验证实，银杏酸(是在标准银杏叶提取物的生产过程中必须要清除的主要内源性毒副成分)，具有相当大的细胞毒性。在中性红摄取试验中显示，银杏酸能剧烈降低细胞的存活率，而标准银杏叶提取物在这个试验中则几乎没有显示出类似的毒性作用。中性红是一个重要的染料，它能渗入活细胞的溶酶体里面。在这个实验中中性红摄取试验是一个提示细胞存活和生长的基本的方法。从标有染料的细胞中提取的中性红的数量在暴露于被检试剂48小时后的一个短的时间周期内(3h)减少，可能由于细胞毒性和/或细胞增殖抑制的两者作用所致。
　　为了进一步分析引起中性红摄取减少的机制，我们分别分析了从胞浆和溶酶体释放的两个关键酶。这个研究揭示，银杏酸引起胞浆释放LDH的浓度与抑制中性红摄取的浓度很接近，提示后一实验的活动是通过细胞膜的损伤介导的。相反，标准银杏叶提取物即使在很高的浓度也不能诱导LDH的释放，提示这个提取物不具有细胞毒性，而只能抑制细胞增殖。
　　近来也报导，用台盼蓝排出法发现，银杏酸对培养的小鸡胚胎神经元有明显的细胞毒性作用。类似地，大鼠的原代肝细胞在银杏酸浓度超过10mg/l时培养可观察到细胞死亡。然而，在远远低于毒性阈值的浓度下(0.1-3mg/l)，发现银杏酸能引起DNA链的断裂和诱导细胞的增殖，提示银杏酸具有遗传毒性且是肿瘤促进剂。
　　不幸的是，细胞表面的溶酶体酶ACP无法检测到，因为发现银杏酸具有很强抑制这个酶的作用，而排除了它的测量。这个结果与Ahlemeyer等人的报导的结果相一致。这些研究者发现，银杏酸能特异地增强蛋白磷酸脂酶2C的活性，而强力抑制另外的磷酸脂酶如蛋白磷酸脂酶1A、2A和2B、酪氨酸磷酸脂酶和ACP的活性。
　　电子显微镜的形态学检查揭示银杏酸在两个被观察的细胞中都能引起不同的结构变化。在含银杏酸培养基培养下，胞浆内脂肪髓磷脂化小体的形成是HaCaT人角化细胞的最明显的形态学改变。一种假说认为，脂肪髓磷脂化小体是两性复合物结合于细胞膜的脂质和其他的细胞组分所致，因此改变了脂质的物理化学性质，当他们被溶酶体吞噬后难以被消化。另一假说认为两性复合物能选择性地抑制溶酶体酶。无论如何，溶酶体内脂质的堆积最终将导致细胞的死亡。相反，如肾小管上皮细胞LLC-MK2 与银杏酸一起培养，可观察到线粒体的长形样转变，这个可解释为氧化磷酸化解联作用的结果。以往的报道也证实了这种毒性作用。已知解联氧化磷酸化能导致细胞死亡，因此至少在对上皮细胞而言，这是烷基酚引起细胞毒性的关键机制。
　　随着HaCaT细胞与银杏酸培养18小时，我们观察到明显的浓度依赖的Apo2.7抗体阳性细胞的增加。这种抗体能与正处于凋亡状态的细胞上的38kDa的线粒体膜蛋白反应，这个标记并不是特异的，在正常程序死亡细胞上经细胞膜渗透毒素处理过后也可检测到。在小鸡神经元银杏酸诱导的细胞死亡也显示出凋亡的特征，如染色质的浓缩、核固缩和蛋白合成的依赖。此外，细胞坏死的征象也很明显，既无DNA的断裂也无caspase-3的活化。因此，这个研究揭示，银杏酸具有复杂的细胞毒性作用，而这依赖于细胞类型和所使用的浓度，能引起不同模式的细胞损伤，可能最终达到细胞的凋亡或坏死。
　　尽可能获得高纯度的具有治疗价值的活性成分；尽可能去除有致敏、致光敏或其他毒性的成分是标准化医学植物提取得以广泛应用的一个基本原则。我们的结果证实银杏酸除了其他毒性外还具有相当大的细胞毒性。因此，在标准化银杏叶提取物的制造中，需应用上述标准，即在确保活性成份发挥治疗作用所需的最小浓度要求前提下，尽可能去除含烷基酚的成分。正是由于对提取液质量的严格控制，标准银杏提取物才能拥有一个相当低的药物副反应机率。在44个临床实验中观察10000多个病人，只有约0.52%的不良反应发生率。综合已经证实的在治疗外周或脑循环障碍性疾病以及不同病因老年痴呆症的临床功效，符合上述要求的标准银杏叶提取物，显示了其很好的治疗利益-风险比。
　　总之，在生产标准银杏叶提取物过程中，基于毒理学角度的考虑及药物的安全性原则，银杏酸及其他烷基酚必需得到较为彻底的清除，不允许银杏酸的浓度超过标准(5ppm)水平。曾报道一个妇女因服用含大量银杏酸的产品而发生全身性的接触性皮炎的事故，此后该标准得到临床的重视。
　　关于从标准植物提取物中识别和除去重要毒性成分，应用人和动物不同器官来源的细胞系是一种适合且有用的方法。

为什么说关于从标准植物提取物中识别和除去重要毒性成分，应用人和动物不同器官来源的细胞系是一种适合且有用的方法？

灵异怪医

银杏——活化石植物药
银杏内酯是特异性血小板聚集抑制剂，能够抑制PAF同血小板分子膜受体的结合。PAF作为一种重要的血小板聚集活化因子，具有广泛的生物学活性，是多种疾病发病的介质之一。  
  


　　银杏及其近缘植物是约1.5亿年前（）时代的主要植物。
　　A 三叠纪和侏罗纪 　　B 三叠纪和白垩纪 　　C 侏罗纪和白垩纪
　　过去的二十年，随着大量中草药、处方药及作为辅助药品的健康食品的出现，全世界范围内，特别是在发达国家，掀起了一场绿色浪潮。在中国，高等植物往往被用作药源，这一传统已有数千年之久。今天，对于中草药的研究已不再完全以经验为指导，植物也在为基础研究提供着巨大的支持， 特别是在有效成份、药理及临床特性等方面。银杏是一个典型的例子，这一植物活化石正处于这次绿色浪潮的前沿。
有趣的活化石树
　　
　　银杏是一种雌雄异体的活化石﹝1,2﹞，是银杏科仅存的代表性树种。银杏及其同属植物(约50个树种)是约1.5亿年前侏罗纪和白垩纪的主要植物。由于第三纪和接下来的第四纪冰川期的地壳剧变，大部分的银杏科植物从地球上消失了。唯有中国的部分银杏树存活下来, 而且与白垩纪的祖先相比，其特征几无变化。在中国，银杏树被普遍栽种已有数个世纪的历史，常用于装饰佛教寺庙旁边的空地。
　　银杏树的生命力顽强，对昆虫、细菌、病毒和真菌等有很强的抵抗力，其叶子的提取物可破坏多种细菌的生长，并具有抗真菌和昆虫拒食等活性。在中国，银杏被称为“长寿树”。20世纪60年代，被发现的树龄超过一千年的银杏树就有360棵左右。据称，最老的银杏树，是在山东省浮来山菊仙村发现的，该树有“银杏王”之称，树龄达3400年之久，换句话说秦始皇造兵马俑时，这棵树就已经是一千二百多岁了。可以说，银杏这一植物活化石存在于地球上的时间比其它任何树都要长，它具有非常强的适应各种生存环境的能力，而被广泛的作为行道树。
　　早在中国宋代的时候，银杏的种子就已被作为药用，《日用本草》一书中对此做了最早的记载，随后许多中草药书籍都有对银杏药用特性的描述。李时珍编著的中国古代著名的医药巨著《本草纲目》中记载，银杏种子有解酒、化痰、治疗哮喘、止咳等诸多功效﹝3﹞。在现代《中国药典》中也指出，银杏种子和叶子对心脏和肺有益，主要作用有治疗哮喘、止咳、化痰、止痛、促进血液循环及驱虫等﹝4﹞。现在，这些功效大部分都可以通过现代药理学和临床研究加以解释。
具有新颖独特结构和生物活性的银杏萜内酯
　　
　　银杏萜内酯（包括银杏内酯A,B,C,J,M和白果内酯）是银杏叶制剂的主要活性成分。作为强效血小板活化因子(PAF)拮抗剂的银杏内酯是一种独特的笼状分子，至今仅在银杏中发现。
　　Braquet等对银杏内酯的化学、生物、药理及一些临床方面的情况作了综述﹝5﹞。银杏内酯是特异性血小板聚集抑制剂，能够抑制PAF同血小板分子膜受体的结合。PAF作为一种重要的血小板聚集活化因子，具有广泛的生物学活性，是多种疾病发病的介质之一，可以引起哮喘、PAF诱导的血栓、心脑血管疾病、急性炎症及其它免疫失调症等。因此血小板活化因子拮抗剂有可能对上述疾病有防治作用。除了其药理学研究前景，银杏内酯的临床研究也为新药的开发开辟了道路。
　　白果内酯，也是银杏萜内酯的一种，同银杏内酯的结构紧密相关，很可能是其新陈代谢的产物。白果内酯可以用于治疗神经性疾病，对神经元及神经组织有营养和保护作用, 此外, 它对运动神经元的再生也有一定作用。总的来说，白果内酯是银杏叶制剂组成中起到神经药理学作用的重要化合物。
　　除了上述的成分外，银杏叶制剂中还含有许多其它生物活性成分﹝6﹞。银杏叶提取物中银杏黄酮甙是主要的抗氧化、清除自由基成分；犬尿喹啉酸和6-羟基犬尿喹啉酸既可竞争性也可非竞争性地结合NMDA受体，作为NMDA拮抗剂已被证实可以减轻脑缺血。在某些动物模型中，还可以治疗NMDA导致的神经损伤等；烷基酚类，如银杏酸衍生物和相关的苯酚，则具有致敏作用。4-甲氧基吡哆酸是银杏种子中的主要毒性成分，为维生素B6的拮抗剂和神经毒素，它在银杏叶中也有少量存在。此外，对银杏叶提取物中的花色素苷和类丹宁酸等毒性成分和残留物也要进行严格控制。
　　很多科学家认为银杏制剂的临床作用并不是由一种化学成分决定的，而是多种活性成分共同作用的结果。因此，药用银杏叶提取物的制备就要尽量增加有效活性成分，减少甚至去除无效和有毒成分。在欧洲，其主要的制备工艺是采用溶剂萃取，在中国则以大孔树脂吸附为主﹝7﹞。
　　根据德国卫生部E委员会GBE(银杏叶提取物)的标准，银杏叶制剂必须含有22-27%的黄酮醇苷，5-7%的银杏萜内酯（其中含2.6-3.2%的白果内酯），所有的银杏酚酸必须低于5ppm﹝8﹞。目前，中国自主生产的银杏提取物，有些品种在有效成分、白果内酯含量配比以及毒性成分银杏酚酸控制方面已能与欧洲同类产品相似。
药效及安全性
　　
　　可以说银杏叶提取物(GBE)并不是新产品，其中的EGb761在德国已经上市25年，中国的情况也基本类似。《银杏叶提取物研究进展》(Advances in Ginkgo biloba extract)一书中对EGb761的药理学及临床功效均有细致的阐述。陈等对中国的银杏叶提取物的临床和药物疗效方面也作了相关的论述﹝9﹞。
　　“具有多重价值”一词被用于描述银杏叶制剂的药理学功效，因为它们是多种活性成分组合产生的作用﹝10﹞。大量的体内外药理学研究和多次临床试验结果表明“具有多重价值”可分为:血管和组织的保护作用及认知增强作用，后者归功于其对老年人认知功能减退的改善。这些作用的机理包括：改善缺血、防止水肿、抑制毛细管通透性的增加、缓解血管痉挛、抗氧化清除自由基、抑制血小板凝聚和防止血栓形成等等。此外，银杏叶提取物还具有许多重要的神经性功效如脑保护作用、类胆碱作用和防止神经细胞凋亡等作用。
　　中国和欧洲所进行的动物和人体试验均表明银杏叶提取物总的毒性较低，以EGb761为例，据44次临床试验结果统计，9772个病人中仅有51人出现了不良反应﹝11﹞。1986年对EGb761所做的一次药物动力学研究表明，至少60%口服银杏叶提取物可以被人体吸收，主要分布于腺组织、神经组织、视觉组织等处，健康自愿者口服4g的提取物(相当于1g的黄酮醇苷)，通过尿样分析发现，原黄酮的代谢产物含量不足30%。对健康自愿者的银杏叶提取物口服试验显示银杏内酯A的生物利用度为98－100%，银杏内酯B为79－93%，白果内酯至少为70%。
适应证
　　
　　在德国、法国和中国，银杏制剂被注册为药物，而在大多数国家，银杏制剂则作为营养食品或辅助治疗剂。银杏制剂在很多国家被广泛应用于心脑血管疾病的治疗。银杏叶提取物的主要适应症有：（1）脑供血不足，包括以下症状：眩晕、头昏眼花、耳鸣、头痛、失忆、智力下降、沮丧、抑郁及运动功能紊乱等；（2）外周血管疾病，如下肢动脉病以及相关的营养缺乏并发症、末梢血管收缩紊乱和微循环问题；（3）脑卒中及颅脑损伤后遗症等﹝12﹞。在中国，银杏叶提取物制剂主要用于缺血性心脑血管疾病的治疗和预防，如心绞痛、脑梗塞和脑功能障碍等。
　　最近，由于对痴呆患者有潜在临床疗效，银杏叶提取物还引起了神经病学专家们的兴趣。Ernst和Pittles进行了九次随机双盲安慰剂对照试验用来评估银杏叶提取物对痴呆症的治疗效果，大部分的试验数据支持了GBE在延缓痴呆症和改善临床症状方面的作用﹝13﹞。尽管银杏叶提取物对痴呆症的疗效相对有限且需要进一步的临床研究，但英国和德国的药典已将痴呆症列为银杏叶提取物制剂的适应症之一﹝14﹞。
结论
　　
　　银杏是具有重要生物学意义的有趣的活化石植物。本文简要的从植物学、药物作用机制、药理学和临床应用等方面对银杏制剂进行了综述。银杏叶提取物作为用于心脑血管疾病的药物或健康食品已在一些发达国家得到了广泛应用。最近银杏叶提取物还被用于阿尔茨海默氏病和血管性痴呆中，在已有的治疗病例中起到积极作用，尽管确切的疗效还有待在更多病例中进一步观察。
　　目前，从银杏中共提取出200多种化合物，但每一种化合物的作用机制尚未完全明确。最新研究表明同心血管疾病相关的活性化合物存在于亲水部分，乙氯基化合物存在于亲酯部分。对于老年痴呆和其它神经功能紊乱（如帕金森氏病）等疾病的确切疗效和作用机制还需要进一步的观察和研究。
从药物经济学角度探讨银杏叶提取物的药用前景。

参考文献

灵异怪医

葛根素注射液治疗糖尿病周围神经病变的疗效观察
葛根素在人体内有可能是一种醛糖还原酶抑制剂，可降低组织中山梨醇含量，纠正糖尿病时减低的神经传导速度。

  


　　以下有关糖尿病周围神经病变的描述是否正确：
　　A 10-50%的糖尿病患者将并发周围神经病变
　　B 糖尿病慢性并发症的发病机制可能与长期高血糖状态引起的一系列代谢紊乱有关
　　
　　 糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病常见的慢性并发症，其发生率达10%～50%，严重影响患者的生活质量，其发病机制尚未完全清楚。目前研究可概括为高血糖所致小血管病缺氧缺血和代谢异常两个方面，而后者有多元醇旁路活化和蛋白非酶性糖化异常。我们以具有活血化瘀、改善微循环和对醛糖还原酶及蛋白非酶性糖基化均有抑制作用的葛根素(Puerarin)治疗糖尿病周围神经病变66例，并与以甲钴胺治疗的对照组进行比较，报道如下。
对象和方法
　　
一、对象
　　本组88例糖尿病并发周围神经病变患者均符合文献[1]的标准及其他有关文献制订的糖尿病周围神经病变的诊断标准。本组88例中未见有糖尿病神经病变恶病质病例。
　　88例糖尿病周围神经病变患者在治疗前1个月内血糖控制稳定。随机分为2组：治疗组66例，男34例，女32例，平均年龄58.4±6.3岁(42～78岁)；糖尿病病程平均12.8±6.4年(2～34年)；周围神经病病程平均4.2±0.9年(1～9年)。对照组22例，男12例，女10例，平均年龄56.9±6.1岁(43～75岁)；糖尿病病程平均11.6±5.7年(2～31年)；周围神经病病程平均3.9±1.1年(1～8年)。两组患者的性别、年龄、糖尿病病程、周围神经病病程均相似(P>0.05)，具有可比性。
二、方法
　　1.治疗方法：两组患者在治疗期间，降糖药物和饮食与治疗前保持不变，并给予维生素B1 100mg、维生素B6 100mg，肌注，每日1次。治疗组在以上基础上，给予葛根素注射液500mg加入0.9%氯化钠溶液250ml，静脉滴注，一天1次，共60天；对照组22例给予甲钻胺500μg，口服，一天3次。
　　2．观察项目及方法：
(1)所有病例在治疗前及治疗后，于清晨空腹卧床休息30分钟后进行腱反射、膝反射检查，并逐项询问观察自觉症状轻重并作记录。
(2)肌电图检查：采用丹麦产DISA 2000型肌电图仪，在治疗前后对全部患者作神经电生理检查。室温保持在20～28℃，患者皮肤在24～30℃。使用表面电极(刺激和记录)，测定主侧肢体的正中神经(腕至肘)、腓总神经(踝至腓骨小头)的运动传导速度(MNCV)，测定主侧肢体的正中神经(中指至腕，顺向)、腓浅神经(腓骨中段至踝，逆向)的感觉传导速度(SNCV)。
(3)空腹血糖(FBG)和糖化血红蛋白(HbA1c)的测定：血糖用氧化酶法，糖化血红蛋白用亲和层析法。
(4)血流变学检查：以WX-813血液粘度细胞电泳仪测定全血粘度(ηb)和血浆粘度(ηp)；以WZ-10血栓形成血小板粘附仪测定血小板粘附率(PAD)，以DZX-200型核孔膜变形能力测定红细胞滤过指数(IF)。
(5)红细胞山梨醇：采用山梨醇脱氢酶(SDH)法测定，肝素抗凝。
结果
　　
一、疗效判断标准
　　显效：自觉症状消失，腱、膝反射基本恢复正常，肌电图NCV增加>5m/s或恢复正常；
　　有效：自觉症状明显减轻，腱、膝反射未完全恢复正常，肌电图NCV较治疗前增加<5m/s；
　　无效：自觉症状无好转，膝、腱反射无改善，肌电图NCV无变化。
二、疗效
　　经60天治疗后，两组疗效比较如表1。提示：葛根素注射液治疗糖尿病周围神经病变效果优于甲钴胺。
表1　两组疗效比较(例，%)
组别
例数
显效
有效
无效
总有效率（%）

治疗组
66
34（51.51）**
25(37.87)
7(10.60)
89.39*

对照组
22
5(22.72)
8(36.36)
9(40.90)
58.10

　　与对照组相比*P<0.05，**P<0.01
三、两组治疗前后MNCV和SNCV变化比较
表2　两组治疗前后MNCV和SNCV变化
组别
例数
   MNCV（m/s）
SNCV（m/s）

正中神经
腓神经
正中神经
腓神经

治疗组
66
治疗前
治疗后
差值
42.8±3.8
51.6±4.9*
+88±1.2
38.3±3.1
45.1±3.9*
+6.8±0.8
38.7±3.3
42.7±4.1*
+4.1±0.8
32.7±4.1
39.5±4.4*
+6.8±0.9

对照组
22
治疗前
治疗后
差值
42.8±4.1
47.2±4.3&#35;
+4.4±0.4△
38.4±3.3
40.2±3.6&#35;
+1.9±0.5△
38.4±3.4
40.2±3.5&#35;
+1.8±0.1△
32.2±3.9
36.3±4.2&#35;
+4.1±0.4△

　　治疗组治疗前后比较*P<0.01，对照组治疗前后比较&#35<0.05；治疗前后差值的组间比较△P<0.01
四、两组在治疗前后空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、血流变学检查和红细胞山梨醇变化
　　表3　两组在治疗前后FBG、HbA1c、红细胞山梨醇及血流变学的变化
组别
例数
   FBG（mmol/L）
HbA1c(%)
ηb
ηp
PAD(%)
IF
红细胞山梨醇（nmol/s·Hb）

治疗组
66
治疗前
治疗后
差值
8.8±1.3
7.9±0.9
>0.05
9.1±1.8
6.6±0.9
<0.01
6.0±1.8
3.9±0.9
<0.01
1.90±0.17
1.58±0.18
<0.05
65.81±7.51
44.31±6.23
<0.01
0.69±0.13
0.57±0.11
<0.05
61.4±16.4
46.9±8.5
<0.05

对照组
22
治疗前
治疗后
差值
8.7±1.1
8.1±1.0
>0.05
8.9±1.6
8.7±1.5
>0.05
6.0±1.5
5.8±1.4
>0.05
1.81±0.18
1.79±0.21
>0.05
64.91±6.35
62.09±5.16
>0.05
0.68±0.21
0.66±0.13
>0.05
61.2±15.6
59.3±9.4
>0.05

讨论
　　早在1798年，Rollo就对DPN作了临床描述，然而其发生机制迄今尚未阐明。最近研究认为在糖代谢紊乱的基础上多种因素共同作用的结果。首先是在本世纪初提出的血管性缺血缺氧假说，由于高血糖导致微血管病变，供应营养神经的血管发生病变而闭塞，导致神经营养障碍，加之神经细胞肿胀遂引起退行性病变。
　　葛根素是从豆科多年生落叶藤木植物的干燥根中提取的单体-异黄酮化合物。现代药理研究表明其能降低血液粘度、抑制血小板聚集，降低TXA2的水平，并能使明显增高的血浆内皮素、血管紧张素II及肾素活性降低，扩张微动脉，改善微循环，增加神经血流量，改善缺血缺氧，提高神经传导速度。目前认为持续高血糖能引起体内多种蛋白的非酶糖化，蛋白非酶糖化在糖尿病慢性并发症的发病中起重要作用，而动物实验证实葛根素对蛋白非酶性糖化有较强的抑制作用。从本组实验中，治疗组在治疗后空腹血糖虽有下降，但无统计学意义，而糖化血红蛋白有明显下降(P<0.01)，说明葛根素确能抑制蛋白非酶性糖化，有可能成为一种蛋白非酶性糖化抑制剂。另外在本组观察中葛根素治疗后红细胞山梨醇明显下降(P<0.01)。目前认为高血糖能够激活一些组织醛糖还原酶的活性，使葡萄糖通过多元醇代谢道路转化为山梨醇而在组织中过度蓄积，这是引起糖尿病一些慢性并发症的重要原因。醛糖还原酶抑制剂可降低组织中山梨醇含量，纠正糖尿病时减低的神经传导速度。虽然我们只测定红细胞山梨醇含量，但已经证实晶体及坐骨神经山梨醇含量与红细胞山梨醇有良好的相关性，红细胞山梨醇的变化在一定程度上可反映体内山梨醇的代谢状况，证实葛根素在人体内有可能还是一种醛糖还原酶抑制剂，与张家庆等的动物实验所得到的结论相同。
　　综上所述，葛根素治疗DPN作用是多方面的。本组实验结果亦表明葛根素注射液治疗DPN疗效是满意的，且无明显的毒副作用。本研究对难于医治的糖尿病周围神经病变的防治提供了一条有希望的新途径。

　综合本文和其他研究，说说葛根素治疗DPN作用机理有哪些？

灵异怪医

葛根素注射液对急性心肌梗死患者梗死面积及心功能的影响
葛根素对急性心梗患者的缺血心肌有保护作用。其作用机制除了与葛根素的通络、活血、化瘀等功效有关外，可能与其抗脂质过氧化物及改善血管内皮细胞功能的作用有关。

  


　 　下列有关葛根素的描述正确的是：
　　A 葛根素是用豆科植物野葛的干燥根中的提取物制成的注射液
　　B 化学名为4，7一二羟基-8-D-葡萄糖基异黄酮，有增加脑血流量及冠脉血流量的作用
　
　　急性心肌梗死(AMI)时梗死面积和心功能对患者的预后有非常重要的意义。我们通过采用QRS记分法、核素心室造影及对AMI患者血浆脂质过氧化物(LPO)、红细胞膜超氧化物歧化酶(SOD)及血管内皮细胞(CEC)数的检测，了解葛根素注射液对AMI患者梗死面积，心功能状态及心肌保护作用的影响。
资料与方法
　　
一、研究对象
　　1997年1月～1999年1月住院的68例急性前壁心肌梗死患者随机分为：葛根素治疗组(n=37)和非葛根素治疗组(对照组，n=31)。治疗组37例中，男29例，女8例，年龄38～74岁，平均61.5岁；对照组31例中，男26例，女5例，年龄39～77岁，平均62.4岁。病例均剔除下壁梗死及有束支传导阻滞等影响ORS记分的患者。两组患者均在AMI症状出现后24小时内收入院，且在年龄、性别、梗死部位及溶栓方面两组无统计学差异。
二、研究方法
　　1．治疗方法：治疗组在常规治疗基础上加用静脉点滴葛根素注射液 500mg，每日一次；对照组按常规治疗方法，不应用葛根素，疗程均为3周。
　　2．0RS记分及梗死面积预测：于住院即刻、第3、7、14、21 天描记常规12导联心电图，用Wagner等的QRS记分法测出每份心电图的分值，即测量各导联(除III、aVR导联)的Q波和R波宽度，R/Q及R/S波振幅比值，计算出分值，将各项分值相加即得1份心电图的分值。根据心电图分值，按照Yoshihko公式预测梗死面积，
　　3．心功能测定：两组患者分别在治疗后3周末使用法国产Sopha DST双探头SPECT显像仪进行门控心血池心室核素造影，测定左室射血分数(LVEF)、峰射血率(PER)、峰充盈率(PFR)。
　　4．用药前和用药3周末测定血浆LPO、SOD及CEC：LPO测定采用八木国夫法；用丁克祥法测定SOD；血管内皮细胞分离与计数采用Percoll(比重1.050)密度梯度法，分离出的血管内皮细胞以Ⅷ因子相关抗原做鉴定。
　　5．统计学处理：用美国Systat统计软件包对资料进行分析，组间比较采用t检验、方差齐性检验。数据以x±s表示，P<0.05为有统计学意义。
结果
　　
　　1．QRS记分治疗前后变化：葛根素治疗2周QRS记分值明显减低，3周后下降更显著(P<0.01)。根据面积计算公式，梗死面积由治疗前36.0％下降至24.7％，对照组无显著改变。见表1。
表1　治疗组与对照组QRS记分及梗死面积比较（x±s）
时间
治疗组（37例）
对照组（31例）

QRS记分
预测梗死面积（%）
QRS记分
预测梗死面积（%）

入院即刻
3d
7d
14d
21d
5.22±0.44
5.46±0.40
5.02±0.38
3.68±0.28*△
3.08±0.30**△△
36.04
37.31
35.00
27.86
24.67*△
5.30±0.40
5.21±0.42
5.56±0.32
5.21±0.38
5.03±0.34
36.46
36.04
37.90
36.04
35.08

注：治疗前后对比，*P<0.05, **P<0.01，两组间对比，△P<0.05,△△P<0.01
　　2．静脉滴注葛根素疗效：3周后LVEF及PER较对照组明显提高，在左室收缩功能改善的同时，舒张功能也得到好转，PFR明显较对照组高。见表2。
表2　两组核素心血池心室造影心功能参数比较（x±s）
组别
LVEF（%）
PER（EDV/S）
PFR（EDV/S）

治疗组（35例）
对照组（30例）
54.36±9.82*
36.45±9.55
2.86±0.46**
1.62±0.45
2.66±0.48**
1.47±0.50

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，PER：峰射血率，PFR：峰充盈率
　　3．AMI患者血浆LPO及CEC变化：治疗3周后较治疗前显著降低，而SOD显著升高，对照组无显著改变。见表3。
表3　葛根素对AMI患者血浆LPO、SOD及CEC的影响（x±s）
组别
血浆LPO（nmol/ml）
红细胞SOD（U/g Hb）
CEC(cells/0.9μl)

治疗前
治疗后
治疗前
治疗后
治疗前
治疗后

治疗组（37例）
对照组（31例）
3.82±0.23
4.08±0.24
2.14±0.22*△
3.88±0.21
1668.20±243.32
1682.55±236.28
2248.72±301.26*△
1637.25±312.34
9.84±3.40
9.72±3.43
6.64±3.50*△
8.87±3.48

注：治疗前后比，*P<0.01；治疗前后组间比，△P<0.01
　　4．副作用：治疗期间未发现葛根素毒副作用。
讨论
　　ORS记分是一种简便而较精确的方法，对AMI梗死面积及左室收缩功能的判断具有重要意义。Ideker等对21例前壁AMI尸检的心脏切片，用重量百分比求出梗死面积，与QRS记分进行对比，发现QRS记分与梗死面积相符。YoshihL等发现AMI的QRS记分与患者血清CK-MB峰值呈正相关。国内学者亦取得一致结果。而核素心室造影是目前评价心功能的金指标。本研究发现AMI患者静滴葛根素2周QRS记分及梗死面积明显减小，静滴3周后改变更显著，左室收缩及舒张功能改善；非葛根素治疗组无此现象。表明葛根素注射液有利于防止AMI患者急性期梗死的延展和心功能的改善。葛根素是从中药葛根中提取的有效成分，其药理学基础是扩张冠状动脉，改善缺血区血流，并使血压下降、心率减慢，外周阻力降低，心肌耗氧量减少，从而缩小梗死面积，改善心肌功能。
　　本研究显示：葛根素能显著降低血浆脂质过氧化物及血管内皮细胞数，而升高红细胞膜超氧化物歧化酶，提示葛根素对AMI患者的缺血心肌有保护作用。其作用机制除了与葛根素的通络、活血、化瘀等功效有关外，可能与其抗脂质过氧化物及改善血管内皮细胞功能的作用有关。
葛根素注射液可以防止AMI患者急性期梗死的延展，有利于心功能的改善，其药理学基础是什么？

灵异怪医

葛根素干预冠心病患者胰岛素抵抗的研究
　CHD患者的血脂、纤溶活性异常可能均源于IR的存在，三者之间相互作用，协同增加了心血管事件发生的危险性。葛根素治疗后，胰岛素分泌量减少，胰岛素敏感性提高，对防止HIS和IR的发生是非常有意义的。

  


　　目前认为胰岛素抵抗(IR)可能是一独立的心血管危险因素，在冠心病(CHD)的发生、发展中具有重要作用。高胰岛素血症(HIS)及IR导致的体内生化、代谢改变和纤溶活性改变，可能引发血栓形成倾向，加重冠状动脉的粥样硬化并导致急性缺血事件的发生率增加。改善IR可能是减缓CHD病程进展的有效途径之一。本研究探讨葛根素改善CHD患者IR及提高胰岛素敏感性对血脂异常、纤溶机制紊乱的影响。
资料与方法
　　
　　1 研究对象
　　CHD组 依据1979年国际心脏病学会和协会及世界卫生组织(ISFC／WHO)制定的缺血性心脏病的诊断标准，选自1999年1月～2001年1月间门诊及住院的CHD患者共76例，随机平行分为常规治疗组(常规组)和葛根素治疗组(葛根素组)。常规组36例，男26例，女10例；年龄46～75岁，平均(54.8±13.8)岁；体重指数(BMI，24.22±1.79)kg／m2；其中陈旧性心肌梗死19例，不稳定性心绞痛17例；病程3～11年，平均(9.0±5.8)年。葛根素组40例，男28例，女12例；年龄45～73岁，平均(55.5±14.6)岁；BMI(24.45±1.85)kg／m2；其中陈旧性心肌梗死27例，不稳定性心绞痛13例；病程3～12年，平均(8.5±6.2)年。上述病例中陈旧性心肌梗死为发病后3个月以上，心绞痛为发病后1个月以上。所有病例均除外高血压病、糖尿病、内分泌疾病及肝肾功能障碍者。两组患者性别、年龄、BMI、冠心病类型及病程均有可比性。
　　对照组与冠心病组年龄、性别相匹配的健康查体者30名，男22名，女8名；年龄46～74岁，平均(53.8±15.3)岁；BMI(24.18±1.74)kg／m2。经病史询问、查体、血压、心电图、超声心动图、血糖检测均排除器质性心脏病、高血压病、糖尿病。
　　2 方法
　　2.1治疗方法：常规组使用美托洛尔25mg口服，每日2次；单硝酸异山梨酯缓释片60mg口服，每日1次；阿司匹林肠溶片100mg口服，每日1次。疗程均为3周。葛根素组则于常规组治疗基础上加用葛根素500mg加入生理盐水250ml，每日静脉滴注1次，疗程为3周。
　　2.2检测指标及方法：CHD组均在治疗前及治疗结束后，于清晨空腹采取肘静脉血。对照组择期采集空腹肘静脉血样。
　　　　血糖、血脂测定 均应用全自动生化分析仪，使用德国试剂盒。空腹血糖(FBG)测定采用葡萄糖氧化酶法。总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)均采用酶法。变异系数<5%。因本研究中病例TG均小于4.50mmol/L，故低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)采用Friedwald公式计算：LDL-C(mmol/L)=TC - HDL-C - TG／2.2。
　　　　血浆胰岛素测定 采用放射免疫法，严格按照试剂盒说明书操作。批内变异系数8.8%，批间变异系数11.5%。胰岛素敏感性指数(ISI)为空腹血糖与空腹胰岛素乘积的倒数。
　　　　组织型纤溶酶原激活物(tPA)、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)活性测定采用发色底物法，批内变异系数为5.5%，批间变异系数为11%。获得基础血样后，做静脉闭塞试验(VOT)，袖带于上臂充气压力至100mmHg，持续10min再次采血测定tPA活性，以反映内皮纤溶储备功能。
　　3 统计学处理：各项数据均以X±s表示，组间及治疗前后均数的比较均采用t检验。因ISI呈偏态分布，故取其自然对数使之正态化后进行分析。CHD患者以及葛根素组治疗后FINS、ISI与血脂、纤溶指标的关系采用直线回归法分析。
结果
　　
　　1 对照组与CHD组各项指标测定值比较见表1、2。两组FBG差异无显著性(P>0.05)，FINS、ISI、TC、TG、LDL-C、HDL-C、VOT前及VOT时tPA、PAI-1差异均有显著性(P<0.01)。
表1　对照组和冠心病组血糖、胰岛素及ISI比较(x±s)
组别
例数
FBG（mmol/L）
FINS(mmol/L)
ISI

对照
CHD
30
76
4.71±0.63
4.74±0.65
10.11±3.74
15.26±4.61*
-3.77±0.41
-4.22±0.33*

注：与对照组比较，*P<0.01
　　2 CHD组患者FINS、ISI与血脂、纤溶指标的相关回归分析结果：FINS与TC、TG、LDL-C、PAI-1呈显著正相关(r=0.497，0.426，0.252，0.346，P<0.01，P<0.05)，与HDL-C、VOT时tPA呈显著负相关(r=-0.263，-0.321，P<0.01，P<0.05)，与VOT前tPA无显著相关；ISI与TC、TG、HDL-C、PAI-1呈显著负相关(r=-0.422，-0.419，-0.228，-0.296，P<0.01，P<0.05)，与HDL-C、VOT时tPA呈显著正相关(r=0.296，0.298，P<0.01)，与VOT前tPA无显著相关。
表2　对照组与冠心病组的血脂及纤溶指标比较（X±s）
组别
例数
TC
TG
LDL-C
HDL-C
tPA活性（IU/ml）
PAI-1活性（AU/ml）

(mmol/L)
VOT前
VOT时

对照
CHD
30
76
4.73±0.49
5.39±0.88*
1.34±0.27
1.71±0.63*
3.06±0.51
4.04±1.22*
0.52±0.07
0.37±0.13*
0.52±0.07
0.61±0.10*
0.86±0.12
0.61±0.11*
0.61±0.12
0.81±0.21*

注：为对照组比较，*P<0.01
　　3 葛根素组和常规组治疗前后各项指标测定值比较见表3、4。
　　两组治疗前比较，各指标差异无显著性(P>0.05)。葛根素组治疗后，FBG无明显改变(P>0.05)，而FINS显著降低，ISI显著增高(P<0.01)，与常规组治疗后比较，差异有显著性(P<0.01)；TC、TG、LDL-C降低(P<0.05，P<0.01)，HDL-C增高(P<0.01)，但与常规组治疗后比较，TC、TG均无统计学差异，LDL-C、HDL-C则差异有显著性(P<0.05)；VOT前及VOT时tPA活性均较治疗前增高(P<0.05，P<0.01)，PAI-1活性下降(P<0.01)，与常规组治疗后比较，差异有显著性(P<0.05，P<0.01)
表3　常规组和葛根素组治疗前后血糖、胰岛素及ISI比较(X±s)
组别
   例数
FBG（mmol/L）
FINS(mmol/L)
ISI

常规
治疗前
治疗后
36
36
4.73±0.66
4.71±70.64
15.25±4.67
15.27±4.87
-4.24±0.36
-4.26±0.33

葛根素
治疗前
治疗后
40
40
4.75±0.74
4.69±0.62
15.27±4.60
12.21±4.15*△
-4.21±0.32
-4.07±0.32*△

注：与本组治疗前比较，*P<0.01；与常规组治疗后比较，△P<0.01

表4　常规组与葛根素组治疗前后血脂及纤溶指标比较（X±s）
组别
例数
TC
TG
LDL-C
HDL-C
tPA活性（IU/ml）
PAI-1活性（AU/ml）

（mmol/L）
VOT前
VOT时

常规治疗前
治疗后
36
36
5.38±0.82
5.39±0.80
1.72±0.63
1.69±0.61
4.03±1.26
4.02±1.22
0.91±0.13
0.93±0.12
0.37±0.11
0.38±0.10
0.60±0.13
0.62±0.14
0.83±0.23
0.81±0.17

葛根素治疗前
治疗后
40
40
5.36±0.96
5.21±0.84*
1.71±0.6
1.64±0.68*
4.04±1.21
3.41±0.91**△
0.92±0.14
0.97±0.11**△
0.39±0.09
0.43±0.12*△
0.61±0.11
0.71±0.15**△△
0.82±0.22
0.70±0.18**△△

注：与本组治疗前比较，*P<0.05,**P<0.01;与常规组织治疗后比较，△P<0.05,**P<0.01；与常规组治疗后比较，△P<0.05, △△P<0.01
　　4 葛根素组治疗后FINS、ISI与血脂、纤溶指标的相关回归分析结果：FINS与TC、TG、LDL-C、PAI-1呈显著正相关(r=0.572，0.444，0.39l，0.524，P<0.01，P<0.05)，与HDL-C、VOT前及VOT时tPA呈显著负相关(r=-0.355，-0.328，-0.594，P<0.01，P<0.05)；ISI与TC、TG、LDL-C、PAI-1呈显著负相关(r=-0.411，-0.388，-0.366，-0.457，P<0.01，P<0.05)，与HDL-C、VOT前及VOT时tPA呈显著正相关(r=0.407，0.335，0.490，P<0.01，P<0.05)。
讨论
　　IR与CHD的密切关系已被大多数学者所认同。研究表明，IR可能在CHD的发生中起重要作用，并发现IR患者同时存在脂质代谢及纤溶机制异常，这可能是发生急性缺血性事件的重要因素。本研究表明CHD患者存在HIS和IR，而且伴有血脂异常和纤溶性降低，FINS、ISI与血脂和纤溶指标间存在高度相关性，提示HIS和IR在上述危险因素中处于中心位置。应用葛根素治疗后，FINS明显降低，ISI明显增高，表明葛根素可改善CHD患者的IR。
　　IR是导致脂肪代谢紊乱的中心环节，且常先于脂质代谢异常发生。其复杂机制尚不完全清楚。本研究显示，IR与血脂异常存在着高度相关性，而且IR越严重，血脂异常的发生率越高。葛根素治疗后，TC、TG、LDL-C降低，HDL-C增高。表明葛根素可能通过改善CHD患者胰岛素敏感性而对血脂代谢产生影响，从而发挥调脂作用，血脂异常随着IR的改善而改善，但与常规组治疗后比较，仅LDL-C、HDL-C具有统计学意义(P<0.05)，TC、TG虽有下降趋势，但未达统计学意义，可能与样本较小、用药时间短以及IR所影响的部位不同有关。
　　血液纤溶活性降低在缺血性心血管事件的发生中发挥了重要作用。IR患者同时存在PAI-1增高、纤溶机制异常。目前已将tPA、PAI-I活性变化导致的纤溶活性降低列入CHD新的危险因素。本研究亦显示CHD患者急性期后仍然存在纤溶活性降低，表现为tPA活性下降，PAI-1活性增高，以及内皮tPA储备功能减退。而且FINS、ISI与VOT时tPA、PAI-1呈显著线性相关意义，反映IR与纤溶活性降低密切相关。目前认为，HIS、IR以及血脂异常等因素可造成血管内皮功能损害，进而引起内皮纤溶功能降低。本研究表明，应用葛根素能够提高CHD患者tPA活性，降低PAI-1活性，与文献报道一致，而且VOT前及VOT时tPA活性均增高。可能是葛根素通过降低血浆胰岛素水平，削弱胰岛素对PAI-1合成释放的刺激作用，以及改善血管内皮功能，促进内皮合成与分泌tPA，使内皮tPA储备增加而恢复CHD患者内皮tPA储备具有重要临床意义。
　　本研究初步显示，CHD患者的血脂、纤溶活性异常可能均源于IR的存在，三者之间相互作用，协同增加了心血管事件发生的危险性。葛根素治疗后，胰岛素分泌量减少，胰岛素敏感性提高，这对防止HIS和IR的发生是非常有意义的。而且直线回归分析也反映了血脂、纤溶活性及内皮tPA储备异常随着IR的改善而改善，表明葛根素改善IR的作用在CHD治疗中具有重要意义，葛根素改善胰岛素敏感性的机理尚需进一步研究。
对于冠心病患者的胰岛素抵抗、血脂及纤溶活性异常，葛根素治疗有何意义？

  

灵异怪医

葛根素对脑缺血-再灌注时海马CA1区细胞凋亡和c-fos蛋白表达的影响

葛根素的神经保护作用可能通过减少细胞凋亡及下调其相关基因c-fos的表达来实现。

  


　　脑缺血-再灌注时神经细胞凋亡的机制十分复杂。研究表明，Ca2+在脑缺血-再灌注后神经细胞凋亡中起重要的作用，且凋亡相关基因c-fos的表达与Ca2+有关。本研究拟应用具有抑制细胞内Ca2+聚集作用的中药提取物葛根素对脑缺血-再灌注大鼠模型进行药物干预，选择对缺血敏感的海马CA1区，观察用药前后神经细胞凋亡数和c-fos蛋白表达的变化，旨在从分子生物学角度探讨葛根素在脑复苏中的治疗机制。
1 材料与方法
　　
　　1.1 实验动物与分组：健康Wistar大鼠105只，雌雄不拘，平均体重220±50g。动物随机分成3组：假手术组，缺血10分钟再灌注组以及葛根素组(每组又分为3、6、12、24和48小时组，每组各7只)。
　　1.2 脑缺血-再灌注模型：采用Pulsinelli等的方法建立大鼠急性全脑缺血-再灌注模型。以体积分数为0.6%的水合氯醛0.5ml /100g腹腔内注射麻醉，在大鼠颈部背侧切开皮肤，暴露第1颈椎两侧翼小孔，电凝两侧椎动脉，局部缝合。24小时后，动物用乙醚麻醉后做颈前切口，分离两侧颈总动脉，待动物清醒后，以动脉夹夹闭两侧颈总动脉10分钟，造成全脑缺血，而后松开动脉夹行再灌注，缝合皮肤切口。葛根素组于缺血前1小时腹腔内注射葛根素注射液(100mg／kg)，随后每间隔6小时再予以等量注射；缺血-再灌注组缺血前1小时给予等量的生理盐水，以后每间隔6小时再予以等量注射；假手术组只分离第1颈椎两侧翼小孔，但不电凝两侧椎动脉，只分离两侧颈总动脉，但不夹闭。实验中保持大鼠体温37.0±0.5℃，未昏迷或缺血后有癫痫、抽搐等并发症的大鼠均放弃。
　　1.3 标本采集和组织切片制备：在脑缺血-再灌注后3、6、12、24和48小时分别快速处死实验大鼠，分离海马组织，并置于体积分数为10%的甲醛液中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明。常规石蜡包埋，连续切片，片厚4μm。
　　1.4 原位末端标记法(TUNEL)染色：组织切片常规脱蜡及再水合，蛋白酶K(20mg/L)室温下消化30分钟；正常小牛血清37℃下孵育1小时封闭，切片加入TUNEL反应混合液，置37℃温箱内2小时；体积分数为3%的H2O2封闭15分钟；加入辣根过氧化物酶(POD)转换液，湿盒内37℃温箱中孵育1小时；加入二氨基联苯胺(DAB)底物液，显色2-3分钟，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜下分析。
　　1.5 c-fos免疫组织化学染色：各石蜡切片脱蜡至水，体积分数为3%的H2O2灭活内源性酶5～10分钟，蒸馏水洗2分钟×3次；微波修复抗原，滴加抗原修复液，室温5-10分钟，蒸馏水洗2分钟×3次；滴加正常山羊血清，室温20分钟，甩去多余液体，不洗；滴加一抗(兔抗Fos蛋白)，37℃孵育2小时，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2分钟×3次，滴加生物素化二抗(羊抗兔IgG)，37℃孵育20分钟，PBS洗2分钟×3次；滴加链霉亲和素-生物素-酶复合物(SABC)液，37℃孵育20分钟，PBS洗5分钟×4次。DAB避光显色20分钟，苏木素复染，脱水，透明，封片。
　　1.6 统计学方法：光镜下用尺型计数器计数海马CA1区1mm的c-fos蛋白阳性细胞数和凋亡细胞数；数据以均数±标准差(x±s)表示，经SAS软件包处理，采用t检验比较两者之间的差异。
2 结果
　　
　　对照组无fos蛋白表达。如表1和表2所示：葛根素组与缺血-再灌注组比较，凋亡细胞数于再灌注后3-48小时明显减少(P均<0.01)；fos蛋白表达于再灌注3-12小时下降，但无统计学差异(P均>0.05)，24-48小时则明显下降(P均<0.01)。
　　　　　　　　　　　　　表1 脑缺血-再灌注后海马CA1区TUNEL阳性细胞数目（x±s）　　　　　　　　个/mm
组别
缺血-再灌注后时间（h）

3
6
12
24
48

假手术对照组
缺血-再灌注组
葛根素治疗组
4.8±0.8
12.5±1.1△
10.0±1.4*△
5.5±1.1
16.5±1.1△
13.3±1.0*△
5.0±2.3
34.0±3.7△
21.0±3.7*△
5.0±2.4
41.0±4.2△
21.0±4.8*△
5.0±2.1
71.0±5.5△
41.0±3.4*△

注：与缺血-再灌注组同时比较：*P<0.01；与假手术对照同时比较：△P<0.01

　　　　　　　　　　　　表2 脑缺血-再灌注后海马CA1区c-fos蛋白表达阳性细胞数（x±s）　　　　　　个/mm
组别
缺血-再灌注后时间（h）

3
6
12
24
48

缺血-再灌注组
葛根素治疗组
169.3±15.5
167.8±10.9
154.7±10.3
146.3±9.3
132.8±5.2
126.5±3.1
92.7±5.4
67.5±11.5*
58.5±4.9
45.0±3.7*

注：与缺血-再灌注组同时比较，*P<0.01
3 讨论
　　脑复苏后存在脑缺血-再灌注损伤，形态学、生化、药物学和基因等多角度均证明凋亡存在于脑缺血-再灌注损伤中。本实验用高特异性的TUNEL法检测脑缺血-再灌注后海马CA1区凋亡的细胞，结果显示假手术对照组可见少量的凋亡细胞，缺血-再灌注组48小时内未显示有凋亡细胞高峰，但在此时间段内随再灌注时间的延长，凋亡细胞数也增加。
　　细胞凋亡是多基因参与的细胞主动死亡。即刻早期基因(ICE)中的c-fos基因是一种转录调节因子，c-fos的表达能阻断细胞内信号的传导而产生一些死亡因子，细胞凋亡通路中有c-fos表达，表达与DNA损伤及修复有关，并参与细胞周期的调控，具有保护作用，但是不适当的过度表达可干预细胞核的修复功能，而导致细胞凋亡。在正常情况下，c-fos在脑内水平极低，难以测到，多种外界刺激(缺血，感染)可诱导神经系统内c-fos表达。缺血-再灌注可诱导c-fos基因的表达，其产物fos蛋白由胞质转入核内，与c-jun基因的蛋白产物Jun蛋白形成fos-jun异源二聚体，作用于DNA的特殊序列，调节相关基因的转录，发挥第三信使的作用。本实验中缺血-再灌注3小时，c-fos蛋白的表达达高峰后逐渐降低，凋亡细胞随再灌注时间延长而增加，表明c-fos可能诱导晚期促凋亡基因的表达，共同调控细胞凋亡。
　　 研究证实葛根索具有抑制一氧化氮(NO)合成和抗超氧阴离子自由基的作用，还可抑制细胞内Ca2+积聚。众所周知，脑缺血-再灌注损伤神经细胞凋亡的主要原因系由于细胞内Ca2+超载所致。Takei等认为细胞内液Ca2+浓度的升高是凋亡的始动因素。神经细胞内Ca2+大量积聚，激活IP3和cAMP等第二信使，而c-fos基因含有DNA依赖的RNA多聚酶Ⅱ催化的转录启动信号和多腺苷化信号，Ca2+等第二信使进入细胞核后，作用于c-fos基因5';端的调节成分，诱导其转录mRNA。本实验中葛根素治疗组与缺血-再灌注组比较：缺血再灌注3-48小时细胞凋亡明显减少，24小时c-fos蛋白的表达显著下降，提示葛根素的神经保护作用可能通过减少细胞凋亡及下调其相关基因c-fos的表达来实现，为进一步临床应用于脑复苏的治疗提供了理论依据。
从细胞凋亡角度阐述葛根素在脑复苏中的治疗机制。

灵异怪医

白果内酯与神经保护
　白果内酯通过保护0XPHOS的复合物I和III允许线粒体在局部缺血的条件下维持细胞呼吸活动。

  


　　白果内脂具有以下神经保护作用
　　A　防止脑水肿 　　　B　预处理可减少脑缺血范围
　　银杏叶提取物广泛用于治疗脑血管和外周血管机能不全、与痴呆相关的症状，以及可能与老龄和衰老相关的认知衰退和感觉神经损伤。这些提取物经过充分标化后，约含有24％黄酮苷、6％萜烯三内酯(银杏苦内酯)，7％前花青素以及某些低分子有机酸。萜烯三内酯成份之一的 白果内酯约占标化银杏叶提取物的2．9％。本文简要回顾白果内酯具有神经保护特性的相关研究。
白果内酯对脑水肿和脑缺血的疗效
　　
　　早先的大鼠作用试验表明，服用标准银杏叶提取物，即“EGb 761”，可防止由三乙基锡引起的细胞毒性脑水肿，该作用与其白果内酯成分有关。从最近一些试验结果来看，人们认为，白果内酯这种抗水肿疗效的内在机理在于其防止氧化磷酸化(OXPHOS)的解偶联作用及其保护细胞膜抗击由缺氧引起的退化。局灶性脑缺血[大脑中动脉(MCA)闭塞]的小鼠试验表明，用白果内酯(≥5mg/kg s．c．)预处理，脑梗塞区以剂量依赖方式减少。该研究还发现，在大脑中动脉闭塞后立即施用白果内酯10 mg/kg (s．c．)，具有神经保护作用。以白果内酯(每天每公斤10mg)处理沙鼠，用药七天，可导致大脑皮质线粒体第3状态和第4状态的氧耗量，以及呼吸控制率(RCR)的增加。这一作用也可能与神经保护有关，因为第3状态呼吸率和呼吸控制率的增加意味着氧化磷酸化的保存和ATP合成。在另一项研究中，白果内酯抑制了来自大鼠海马切片的胆碱释放的增加，该海马切片事先浇注了无氧缓冲剂(IC50≌ 0.38μM)，表明白果内酯具有抗缺氧引起的胆碱磷酯水解的保护效果。抑制胆碱溢出的增加是白果内酯的特有作用，因为在银杏内酯混合物没有产生这种效果。白果内酯还抑制了N-甲基-d-门冬氨酸(NMDA)引起的(谷氨酸能)磷脂酶A2活化和磷脂衰竭，以及大鼠海马切片的胆碱溢出，后一效果是在采用2.3μM的IC50值时取得的。在给大鼠施用了白果内酯(2—20 6mg/kg，p．o．)后一小时准备海马切片，并在低氧条件下浇注，体外试验进一步说明，白果内酯保护切片免于缺氧引起的磷脂衰竭(体外，IC50≌6mg/kg)。以逆行性透析的方法将NMDA直接注射到自由活动大鼠的海马中也引起了胆碱释放，白果内酯(20mg/kg，i．p．)也同样抑制了该胆碱释放。
白果内酯保护线粒体功能
　　
　　Janssens等已经说明，白果内酯可抑制缺氧引起的血管内皮细胞中ATP含量的降低。这一效果可能与细胞性呼吸功能的增强有关，正如体外试验中发现的那样，大鼠口服白果内酯增加了从肝分离出来的线粒体的RCR。由此可推断，由于局部缺血可使0XPH0S解偶联，白果内酯能抵抗缺氧引起的ATP降低，只要存在一些氧气，就能保存线粒体，重新生成ATP。从采用白果内酯处理的大鼠身上分离出来的线粒体，可以进一步看到，这一类萜可保护线粒体免于安米妥引起的(OXPHOS的)复合物I的抑制，以及抗霉素A或粘噻唑引起的复合物III的抑制。因此，白果内酯可通过保护0XPHOS的复合物I和III允许线粒体在局部缺血的条件下维持其呼吸活动。
白果内酯与细胞存活
　　在浸泡介质中加入白果内酯(10μM)保护了从新生大鼠培养的海马神经元免受兴奋毒性损伤。以白果内酯(0.1μM)预处理从小鸡终脑培养的神经元可对低氧损伤提供极大保护。
　　最近，Ahlemeyer等发现，采用白果内酯(1μM)、EGb761(10μg/ml、银杏内酯B(10μM)和银杏内酯J(100μM)，可将因24小时处于缺失血清状态而引起的凋亡小鸡胚胎神经元上升现象降低到控制水平。白果内酯(10μM)还能将小鸡神经元星形孢菌素处理12小时所引起的凋亡损伤降低到接近控制水平。在取自新生大鼠海马的神经元和星形细胞的混合培养物中，总提取物(EGb761；100mg/l)和白果内酯(100μM)使神经元免于因血清缺失而引起的凋亡，白果内酯(100μM)和银杏内酯B(100μM)降低了星形孢菌素引起的凋亡损伤。研究人员认为，EGb 76l具有抗凋亡活性，白果内酯是最有效的成分。然而，与这些发现形成对比的是，还有一项研究表明，在浸泡成年大鼠海马神经元的主要培养物的介质中加入白果内酯(0.3-3.0μM)，并不能阻止细胞生存能力的降低，也无法防止因暴露于过氧化氢自由基生成物-2，2-偶氮双-2-脒基丙烷而引起凋亡细胞数的上升。细胞类型不同、引发凋亡的方法不同、两种研究中所使用的白果内酯浓度不同都可能是造成这种不一致的原因。
　　另外，还采用嗜铬细胞瘤衍生的PC12细胞做了研究。
　　Zhou等人发现，以β淀粉肽碎片25-35(Abetα(25-35)；100μM)处理PC12细胞达24小时，可显著降低细胞生存能力，而白果内酯(25-100μM)可以浓度依赖方式抑制这一细胞毒素效果。白果内酯还抑制了脂质过氧化作用的上升和Abetα(25-35)引起抗氧化酶活性的降低。在一项相关研究中，Zhou和Zhu表明，白果内酯(25-100μM)如与黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶(自由基生成系统)同时使用，可抑制PC12细胞中活性氧(ROS)引起的凋亡。通过分析DNA碎片，测定流式细胞计数，并评估半胱天冬酶-1和类似半胱天冬酶-3的蛋白酶活动，研究人员相信，白果内酯是通过阻断早期凋亡，然后削弱C-myc、P53和Bax以及半胱天冬酶-3活性的上升，来保护神经元免受氧化压力。
　　以白果内酯(10μM)对PC12细胞进行24小时预处理，也表明它对NO供体3-吗啉-代悉尼酮亚胺引起的损伤具有保护作用，因而能提高细胞生存能力。在这种情况下，过氧化酶和过氧化氢酶的活性增加了，这表明白果内酯的抗氧化和神经保护效果可能包含了抗氧化酶的诱导作用。
白果内酯和基因表达
　　迄今为止，只报道了少数涉及白果内酯和基因表达的研究。有关线粒体OXPHOS，Chandrasekaran等人以神经生长因子鉴别的大鼠PC12细胞的形态变体加以试验，研究结果表明，在培养介质中加入白果内酯 (15.3或30.6μM) 而不是银杏内酯B(11.8或23.6μM)，将细胞色素c氧化酶的线粒体DNA(mtDNA)编码的COX III亚单位提高了两倍。其它试验说明，在诱导完全脑缺血以前，给沙鼠口服七天银杏内酯(每天3或6mg/kg)，可保护海马CA1区神经元免于死亡以及缺氧引起的mtDNA编码的COX III mRNA降低。最近，Tendi等表明，将PC12细胞暴露于白果内酯(30.6μM)达48小时或72小时可增加(约两倍)NADH脱氢酶的DNA编码亚单位的mRNA(ND1) 水平。这些发现也支持白果内酯保护脑能量代谢和提供神经保护的观点。
　　有关NO合成酶(NOS)异构体和N0的产生，Cheung等人研究已经表明，白果内酯(0.8-3μM)抑制了诱导性酶(iNOS)在人体THP-1 巨噬细胞中催化产生NO，但不是通过内皮型一氧化氮合酶(eNOS)在人体内皮细胞(HUVEC)中产生NO。转移免疫印迹分析,结合核酸酶保护分析和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，表明在经过白果内酯处理的巨噬细胞中伴随着iNOS蛋白质量和mRNA的水平降低，但是，白果内酯不影响以eNOS为媒介的NO生成或者HUVEC中的eNOS蛋白质和mRNA的表达。这些结果表明，银杏提取物的白果内酯对iNOS表达具有选择性的抑制作用，不会影响以eNOS为媒介的NO生成。
　　白果内酯还能增加大鼠星形细胞中胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。采用PCR来判定GDNF和VCGF mRNAs，并采用免疫组织化学方法来探测GDNF和VEGF蛋白质表达，结果发现，以白果内酯(50μM)进行12小时处理，可显著提高GDNF和VEGF mRNAs，在以白果内酯(50μM)进行24小时处理后，在星形细胞的细胞质中能探测到GDNF和VEGF蛋白质。
合成白果内酯衍生物
　　迄今为止，有关合成白果内酯衍生物的研究已完成两项。Ahlemeyer等发现，4-羟基-4-叔丁基-2,3,5,6-四氢硫代-1-氧化吡喃(NV-31;1-100 nM)能保护从小鸡胚胎终脑培养的神经元免受因血清缺乏或以浓度依赖方式暴露于星形孢菌素而引起的凋亡损伤。在新生大鼠海马神经元和星形胶质细胞的混合培养物中，NV-31(100nM)还降低了星形孢菌素引起的神经元损伤。还有，在局灶性脑缺血之前一小时和缺血后即刻，给老鼠采用10和20 mg/kg－1处理，梗死区比赋形剂组的动物实验减少。这说明NV-31的抗氧化特性产生了神经保护效果。
　　在另一项研究中，Bouaziz等人发现，和白果内酯本身一样，两种合成白果内酯类似物丙二酸二环戊烯-2-酯(MRC2P119)和2-氧-3-氧杂-双环[3.1.0]己烷-1-羧酸烯丙基酯(MRC2P57)增加了被分离线粒体的RCR，阻碍了安米妥对线粒体复合物I的抑制以及粘噻唑对复合物III的抑制。此外，MRC2P119和MRCP2P57都以浓度依赖方式抑制了缺氧引起的内皮细胞的ATP含量降低，MRC2P119阻碍了因缺氧和缺氧/复氧引起的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞生存能力的降低。研究结论是，这些新的分子具有抗缺血性，这可能应归功于OXPHOS复合物I和III的保护作用。
结论
　　最近几年中积累起来的证据表明，白果内酯具有神经保护作用。看来有必要进行进一步的研究以确定白果内酯治疗脑缺血和神经变性相关疾病的有效性。

　简述白果内酯的神经保护作用机理

灵异怪医

国家一类学分5分！