[转帖]益肾蠲痹丸对大鼠实验性痹证影响的病理学研究

杏林奇葩

益肾蠲痹丸对大鼠实验性痹证影响的病理学研究
      中国中医研究基础理论研究所   吕爱平  王安民   曾晓莲
    益肾蠲痹丸是老中医朱良春主任医师几十年临床经验的结晶，对顽痹（类风湿性关节炎）有明显疗效（1）。为了探讨其治疗机理，我们建立Ⅱ型胶原所致的具有自身免疫反应特征的大鼠关节炎模型，从病理学角度来探讨益肾蠲痹丸治疗痹证的机理。
材料与方法
     一、实验动物组
    选用体重90克左右的Wistar大白鼠43只为实验对象。随机分为三组：造模组20只、给药组15只和对照组8只。
    （一）造模组：将大白鼠放入冷水中（温度为15”C左右），游泳7分钟，每日1次，连续7天（作为寒湿因素）。然后，取终浓度为1．5毫克／毫升的Ⅱ型胶原粗提物的乳化混合物0.125毫升（制作方法参照文献（2~4）并进行改进），于大白鼠尾部、踝部多处皮内注射以免疫动物。每只动物注射一次，含Ⅱ型胶原粗提物约0．18毫克。造模组20只动物分别于免疫注射后第7天、第15天、第30天和第45天，每次5只动物，颈椎脱日处死，取材检查。
    （二）给药组：将15只大鼠，接上组造模法在冷水中游泳及免疫注射。取益肾蠲痹丸（南通市中药厂生产），加水煎制成50％的水煎剂。其中10只动物，于免疫注射15天后，每天灌胃给药1次，每次3毫升，相当于益肾蠲痹丸1．5克，灌胃给药1个月处死；余5只动物于相同时间灌胃，每天1次，每次给蒸馏水3毫升，持续1个月处死，取材检查。
    （三）对照组：将8只大鼠按上法在冷水中游泳，不作免疫注射，处死时间同造模组，分4次处死，每次2只动物。
        二、取材
    取全部动物踝、膝、时和腕关节组织及脾、胸腺；其中各组中部分动物取左膝关节髌骨及其滑膜组织作冰冻切片。部分动物取心、肝、肾、十二指肠、空肠、结肠、肺和肾上腺。断尾取血，涂片。横断脾脏，印片。标本制作及染色方法略。
结    果
    一、造模动物的外形改变
    造模动物毛发失去光泽，懒动，在免疫注射后的第7天和第15天，消瘦明显，体重显著减轻（P＜0.05），部分动物可见踝关节红肿。
   二、关节的病理改变
   （一）造模组：造模动物关节病理变化的发展过程大致可分为二个时期，滑膜受损期（免疫注射后第15天以前）和软骨损伤期（免疫注射第15天以后）。
      1．滑膜受损期：滑膜受损早期（免疫注射后第7天）主要出现滑膜组织充血、水肿，尤其是脂肪垫组织中纤维素渗出。滑膜细胞轻度增生，排列疏松、不规则。滑膜组织中可见淋巴细胞、单核细胞及少数散在分布的中性粒细胞侵润。关节腔内可见淋巴细胞、单核细胞及少量中性粒细胞。关节周围组织（腱周组织和纤维囊周围结缔组织）充血、水肿、淋巴细胞浸润，并可见散在的中性粒细胞和肥大细胞。滑膜受损后期（免疫注射后第15天），除上述改变外，滑膜细胞增生、肥大更为明显，滑膜细胞呈多层柱状排列。滑膜组织中血管扩张充血，毛细血管增生，有的小血管壁轻度增厚。
      2．软骨损伤期：软骨损伤早期（免疫注射后第30天），关节软骨表面扁平层细胞剥脱，甚至软骨细胞变性、坏死，关节软骨表面缺损。滑膜细胞增生明显，呈柱状或不规则疏松排列，有的甚至沿关节软骨表面贴附生长，贴附的滑膜细胞下方软骨表面扁平层细胞剥脱，软骨细胞变性。此时，滑膜组织充血、水肿有所消退，仅见少量的淋巴细胞浸润，但可见成纤维细胞增生和纤维细胞增主、胶原沉着。软骨损伤后期（免疫注射后第45天）病变基本与软骨损伤早期相同，但成纤维细胞、纤维细胞更为多见，有的甚至出现骨的损伤，出现软骨下骨细胞变性、坏死。
    为了便于判断造模组动物的发病情况，参照有关诊断该实验性痹证的诊断条件文献（5一7），结合本研究具有时间序列上变化的特点，以滑膜细胞增生或伴有排列不规则，滑膜组织纤维素渗出和／或胶原纤维沉着、淋巴细胞侵润，或关节软骨破坏为主，来判断是否存在Ⅱ型胶原所致关节炎的标准，只要有一个或一个以上关节出现上述变化，该动物即计为发病例。按这个标准，其发病率为15／20。在所有发病动物的4个关节中，踝关节病变出现率为100％，膝关节病变出现率为93％，腕关节病变出现率为80％，肘关节病变出现率为77％。
    （二）给药组：给药动物灌服益肾罔痹丸水溶液1个月后，在其关节的滑膜组织中淋巴细胞浸润明显减少，炎症减轻，胶原纤维沉着局限于滑膜细胞下。关节软骨细胞缺损部位可见软骨细胞增生、修复。给水动物给水1个月后，其病变与造模组动物在免疫注射后第45天的病变相同。
    （三）对照组：对照组动物关节未见任何病理变化。
    三、其他脏器及注射局部的改变
    造模组和给药组动物心、肝、肾、胸腺、脾、肺。肾上腺、消化道均未见明显变化。注射局部皮下，早期可见大量炎细胞浸润，后期炎细胞浸润明显减轻，亦可见纤维母细胞增生及胶原纤维形成。
    四、酶类的改变
    取动物的脾脏印片及血涂片，染色检查酸性磷酸酶和α一醋酸茶酯酶阳性细胞（％），造模组分4次检查，每次各5次大鼠。免疫注射后第7天平均为63．3±2．69％（均值±标准差，下同）；第15天、30天分别平均为73．3士2．54％、73．95士2．57％，较第7天者显著增高（P＜0．001）；免疫注射后第45天，仍保持在较高水平（72.1±5．7％）。给药组于给药后30天检查，平均为62.5＋2.12％，已恢复到不给免疫注射的对照组水平（61．4±2．0%）。
    检查大鼠滑膜组织中的骁铂酸脱氢酶和细胞色秦酶的结果表明，造模组轻度降低，给药组未见明显变化。
    五、关节滑膜组织荧光抗体检测结果
    成为Ⅱ型胶原所致关节炎模型大鼠的滑膜组织中，用免疫荧光染色法可见黄绿色荧光，表明滑膜组织中有抗体或抗原抗体复合物存在。
讨    论
      一、实验性痹证与人类痹征（类风湿性关节炎）的关系
     本实验性痹证模型建立的依据是：类风湿性关节炎病人血清、关节腔液中可检出抗Ⅱ型胶原抗体（8一13），关节滑膜组织中可检出Ⅱ型胶原一抗Ⅱ型胶原抗体复合物（14）。本实验造成的滑膜细胞增生、滑膜组织中纤维秦渗出、胶原纤维沉着、淋巴细胞浸润、软骨细胞扁平层剥脱甚至全层缺损等，从病理形态学方面证明了该实验性痹证与类风湿性关节炎相似；酯酶阳性细胞增加，酸性磷酸酶活性增高，滑膜组织中有抗体存在，从免疫学角度初步证实该模型类似类风湿性关节炎，与免疫有关。运用临床行之有效的益肾蠲痹丸能使滑膜组织炎症减轻，软骨细胞增生、修复，从疗效方面反证了该实验性痹证与人类类风湿性关节炎有相似之处。
      二、实验性痹证的发病机理
      本实验性痹证发病的可能机制是：Ⅱ型胶原作为抗原进入动物体内，引起机体对Ⅱ型胶原的免疫反应，产主抗Ⅱ型胶原抗体，该抗体随血流到达靶器官，引起激肽系统、纤溶系统等的多方面改变，形成渗出性炎症；继之滑膜细胞增生、肥大。滑膜细胞增生、肥大能引起诸方面的改变：（1）吞噬抗原或抗原抗体复合物，激活其本身的1gGFc受体（15，16）和C3受体(15），造成组织损伤；（2）分泌大量的胶原纤维。(17），引起胶原纤维沉着，阻碍滑膜给予软骨的营养，造成关节软骨损伤；（3）滑膜细胞大量增生，贴附关节软骨表面生长，滑液渗人软骨细细胞受阻，引起关节软骨细胞变性、坏死（18）。但是，滑膜细胞贴附软骨表面生长也可能是修复软骨缺损的一种代偿方式。该实验性痹证与人类类风湿性关节炎相似，也显示慢性炎症过程。其原因可能是由于长期的免疫机制存在，滑膜组织中炎症介质长期储留，活动容易使关节受累，纤维素渗出，改变滑膜的抗原性，引起更为复杂的自身免疫反应，导致恶性循环的慢性过程（19），本实验还加上了寒湿因素致病，因此更接近子中医“风寒湿三气杂至合而为痹”的痹证理论。
      三、益肾蠲痹丸对实验性痹证的作用机理
益肾蠲痹丸是朱良春医师根据数十年的临床实践而总结出来的治疗“顽痹”的有效处方，具有温阳、益肾、壮督、增强机体免疫机能、调整骨质代谢的功效。方中侧重运用虫类搜风之品，以达到抗炎、消肿、止痛之功（1），本研究表明，益肾蠲痹丸能使滑膜组织炎症减轻，胶原纤维沉着减少，软骨细胞增生修复，对实验性痹证有较好的疗效.
本研究得到窦志良、李晓禾、李昆、陈红宾、蔡洪斌、谢崇芩、王乃琪等同志的大办支持和帮助，特此致谢。