葛根素对脑缺血-再灌注时海马CA1区细胞凋亡和c-fos蛋白表达的影响

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葛根素对脑缺血-再灌注时海马CA1区细胞凋亡和c-fos蛋白表达的影响
葛根素的神经保护作用可能通过减少细胞凋亡及下调其相关基因c-fos的表达来实现。

　　脑缺血-再灌注时神经细胞凋亡的机制十分复杂。研究表明，Ca2+在脑缺血-再灌注后神经细胞凋亡中起重要的作用，且凋亡相关基因c-fos的表达与Ca2+有关。本研究拟应用具有抑制细胞内Ca2+聚集作用的中药提取物葛根素对脑缺血-再灌注大鼠模型进行药物干预，选择对缺血敏感的海马CA1区，观察用药前后神经细胞凋亡数和c-fos蛋白表达的变化，旨在从分子生物学角度探讨葛根素在脑复苏中的治疗机制。
1 材料与方法 　　
　　1.1 实验动物与分组：健康Wistar大鼠105只，雌雄不拘，平均体重220±50g。动物随机分成3组：假手术组，缺血10分钟再灌注组以及葛根素组(每组又分为3、6、12、24和48小时组，每组各7只)。
　　1.2 脑缺血-再灌注模型：采用Pulsinelli等的方法建立大鼠急性全脑缺血-再灌注模型。以体积分数为0.6%的水合氯醛0.5ml /100g腹腔内注射麻醉，在大鼠颈部背侧切开皮肤，暴露第1颈椎两侧翼小孔，电凝两侧椎动脉，局部缝合。24小时后，动物用乙醚麻醉后做颈前切口，分离两侧颈总动脉，待动物清醒后，以动脉夹夹闭两侧颈总动脉10分钟，造成全脑缺血，而后松开动脉夹行再灌注，缝合皮肤切口。葛根素组于缺血前1小时腹腔内注射葛根素注射液(100mg／kg)，随后每间隔6小时再予以等量注射；缺血-再灌注组缺血前1小时给予等量的生理盐水，以后每间隔6小时再予以等量注射；假手术组只分离第1颈椎两侧翼小孔，但不电凝两侧椎动脉，只分离两侧颈总动脉，但不夹闭。实验中保持大鼠体温37.0±0.5℃，未昏迷或缺血后有癫痫、抽搐等并发症的大鼠均放弃。
　　1.3 标本采集和组织切片制备：在脑缺血-再灌注后3、6、12、24和48小时分别快速处死实验大鼠，分离海马组织，并置于体积分数为10%的甲醛液中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明。常规石蜡包埋，连续切片，片厚4μm。
　　1.4 原位末端标记法(TUNEL)染色：组织切片常规脱蜡及再水合，蛋白酶K(20mg/L)室温下消化30分钟；正常小牛血清37℃下孵育1小时封闭，切片加入TUNEL反应混合液，置37℃温箱内2小时；体积分数为3%的H2O2封闭15分钟；加入辣根过氧化物酶(POD)转换液，湿盒内37℃温箱中孵育1小时；加入二氨基联苯胺(DAB)底物液，显色2-3分钟，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜下分析。
　　1.5 c-fos免疫组织化学染色：各石蜡切片脱蜡至水，体积分数为3%的H2O2灭活内源性酶5～10分钟，蒸馏水洗2分钟×3次；微波修复抗原，滴加抗原修复液，室温5-10分钟，蒸馏水洗2分钟×3次；滴加正常山羊血清，室温20分钟，甩去多余液体，不洗；滴加一抗(兔抗Fos蛋白)，37℃孵育2小时，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2分钟×3次，滴加生物素化二抗(羊抗兔IgG)，37℃孵育20分钟，PBS洗2分钟×3次；滴加链霉亲和素-生物素-酶复合物(SABC)液，37℃孵育20分钟，PBS洗5分钟×4次。DAB避光显色20分钟，苏木素复染，脱水，透明，封片。
　　1.6 统计学方法：光镜下用尺型计数器计数海马CA1区1mm的c-fos蛋白阳性细胞数和凋亡细胞数；数据以均数±标准差(x±s)表示，经SAS软件包处理，采用t检验比较两者之间的差异。 2 结果 　　
　　对照组无fos蛋白表达。如表1和表2所示：葛根素组与缺血-再灌注组比较，凋亡细胞数于再灌注后3-48小时明显减少(P均<0.01)；fos蛋白表达于再灌注3-12小时下降，但无统计学差异(P均>0.05)，24-48小时则明显下降(P均<0.01)。
　　　　　　　　　　　　　表1 脑缺血-再灌注后海马CA1区TUNEL阳性细胞数目（x±s）　　　　　　　　个/mm
组别
缺血-再灌注后时间（h）
3
6
12
24
48
假手术对照组
缺血-再灌注组
葛根素治疗组
4.8±0.8
12.5±1.1△
10.0±1.4*△
5.5±1.1
16.5±1.1△
13.3±1.0*△
5.0±2.3
34.0±3.7△
21.0±3.7*△
5.0±2.4
41.0±4.2△
21.0±4.8*△
5.0±2.1
71.0±5.5△
41.0±3.4*△
注：与缺血-再灌注组同时比较：*P<0.01；与假手术对照同时比较：△P<0.01
　　　　　　　　　　　　表2 脑缺血-再灌注后海马CA1区c-fos蛋白表达阳性细胞数（x±s）　　　　　　个/mm
组别
缺血-再灌注后时间（h）
3
6
12
24
48
缺血-再灌注组
葛根素治疗组
169.3±15.5
167.8±10.9
154.7±10.3
146.3±9.3
132.8±5.2
126.5±3.1
92.7±5.4
67.5±11.5*
58.5±4.9
45.0±3.7*
注：与缺血-再灌注组同时比较，*P<0.01
3 讨论 　　脑复苏后存在脑缺血-再灌注损伤，形态学、生化、药物学和基因等多角度均证明凋亡存在于脑缺血-再灌注损伤中。本实验用高特异性的TUNEL法检测脑缺血-再灌注后海马CA1区凋亡的细胞，结果显示假手术对照组可见少量的凋亡细胞，缺血-再灌注组48小时内未显示有凋亡细胞高峰，但在此时间段内随再灌注时间的延长，凋亡细胞数也增加。
　　细胞凋亡是多基因参与的细胞主动死亡。即刻早期基因(ICE)中的c-fos基因是一种转录调节因子，c-fos的表达能阻断细胞内信号的传导而产生一些死亡因子，细胞凋亡通路中有c-fos表达，表达与DNA损伤及修复有关，并参与细胞周期的调控，具有保护作用，但是不适当的过度表达可干预细胞核的修复功能，而导致细胞凋亡。在正常情况下，c-fos在脑内水平极低，难以测到，多种外界刺激(缺血，感染)可诱导神经系统内c-fos表达。缺血-再灌注可诱导c-fos基因的表达，其产物fos蛋白由胞质转入核内，与c-jun基因的蛋白产物Jun蛋白形成fos-jun异源二聚体，作用于DNA的特殊序列，调节相关基因的转录，发挥第三信使的作用。本实验中缺血-再灌注3小时，c-fos蛋白的表达达高峰后逐渐降低，凋亡细胞随再灌注时间延长而增加，表明c-fos可能诱导晚期促凋亡基因的表达，共同调控细胞凋亡。
　　 研究证实葛根索具有抑制一氧化氮(NO)合成和抗超氧阴离子自由基的作用，还可抑制细胞内Ca2+积聚。众所周知，脑缺血-再灌注损伤神经细胞凋亡的主要原因系由于细胞内Ca2+超载所致。Takei等认为细胞内液Ca2+浓度的升高是凋亡的始动因素。神经细胞内Ca2+大量积聚，激活IP3和cAMP等第二信使，而c-fos基因含有DNA依赖的RNA多聚酶Ⅱ催化的转录启动信号和多腺苷化信号，Ca2+等第二信使进入细胞核后，作用于c-fos基因5';端的调节成分，诱导其转录mRNA。本实验中葛根素治疗组与缺血-再灌注组比较：缺血再灌注3-48小时细胞凋亡明显减少，24小时c-fos蛋白的表达显著下降，提示葛根素的神经保护作用可能通过减少细胞凋亡及下调其相关基因c-fos的表达来实现，为进一步临床应用于脑复苏的治疗提供了理论依据。 从细胞凋亡角度阐述葛根素在脑复苏中的治疗机制。